弓形虫表面抗原P30、P22及CTXA/B亚基复合基因的构建及在真核细胞中的表达

摘要

本课题根据Genebank收录的弓形虫RH株P30、P22基因序列和霍乱毒素A<,2>/B的基因序列,自行设计合成三对引物,在每条引物的5'末端适当的位置分别加上合适的限制性内切酶酶切位点,以保证开放读码框架的正确性为前提,采用分子生物学定向克隆的方法和基因重组技术,成功构建了复合基因P30-P22-CTXA<,2>/B,并且成功构建了含复合基因的克隆质粒(pUC1 8-P30-P22-CTXA<,2>/B)和真核表达质粒(pcDNA3.1-P30-P22-CTXA<,2>/B),并由脂质体介导转染人宫颈癌细胞系Hela,经过G41 8筛选获得稳定转染的细胞株.同时在稳定转染的Hela细胞中,重组质粒成功表达了复合基因P30-P22-CTXA<,2>/B的融合蛋白,表达产物行SDS-PAGE蛋白电泳显示一条分子量大小约为64KDa的蛋白电泳带,其大小与预计的融合蛋白分子量相符,蛋白泳带转膜至硝酸纤维素膜上,经Western Blotting检测进一步证实该条带为含P30抗原片段的特异性融合蛋白,从而验证了其免疫活性.为今后的动物实验乃至人体试验奠定了基础,为弓形虫复合多价亚单位疫苗的研制提供了候选成份.关于弓形虫疫苗的研制,目前国内外均未见复合抗原与免疫佐剂联合表达的文献报道.本课题首次成功构建了弓形虫主要表面抗原P30(SAG1)及P22(SAG2)与霍乱毒素A<,2>/B亚基的复合基因,并在真核表达系统中成功表达了融合蛋白,同时验证了其具有P30抗原免疫活性.此项研究国内外均未见有报道.

目录

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符号说明

前言

技术路线

第一部分弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A2/B复合基因的克隆质粒与表达质粒的构建

材料与方法

结果

附图

讨论

第二部分融合蛋白弓形虫表面抗原P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

附录、附图表

参考文献

致谢

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