促凋亡基因Bax逆转录病毒载体构建及高表达Bax基因Hela细胞株的建立

摘要

目的:克隆促凋亡基因Bax,构建Bax基因的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-Bax,转染Hela细胞后建立高表达Bax基因的Hela细胞株,旨在探讨Bax基因的表达与肿瘤放射敏感性之间的关系,为Bax基因联合放射疗法治疗肿瘤提供理论依据.方法:1)根据GenBank数据库收录的Bax-α的基因序列,设计特异引物Bax F/R,采用RT-PCR方法从Hela细胞来源的cDNA克隆Bax-α基因序列;2)通过EcoRI和XhoI限制性内切酶位点,将Bax-α基因定向克隆到逆转录病毒表达载体pLXSN中,采用菌落PCR、酶切、测序等方法筛选和鉴定Bax基因重组逆转录病毒表达载体pLXSN-Bax;3)采用脂质体方法将重组逆转录病毒表达载体pLXSN-Bax转染包装细胞PA317,收集PA317细胞瞬时转染产生的病毒颗粒,此PA317细胞再经G418筛选(终浓度800μg/mL),获得能稳定产生病毒包装颗粒的PA317细胞株,用于今后体内实验研究.4)用PA317细胞瞬时转染产生的重组逆转录病毒颗粒转导正常培养的Hela细胞,经G418筛选,获得抗性克隆后,以基因组PCR及RT-PCR半定量分析方法鉴定高表达Bax基因的Hela细胞株.结论:应用RT-PCR技术成功克隆到野生型Bax-α基因并经逆转录病毒转移载体系统高效转入Hela细胞;经RT-PCR半定量分析及基因组PCR证实,此Hela细胞株表达Bax基因明显高于野生型Hela细胞,并且外源Bax基因已成功整合入Hela细胞基因组DNA,高表达Bax基因的Hela细胞株成功建立.

目录

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符号说明

第一部分前言综述

1.Bcl-2和Bax概述

2.Bcl-2和Bax与肿瘤的发生

3.小结、存在的问题及展望

第二部分 Bax基因克隆及逆转录病毒载体的构建

1.材料与方法1

1.材料与方法2

2.结果

3.讨论

第三部分 高表达促凋亡基因Bax的Hela细胞株建立

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

论文总结

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表