siRNA抑制bcr-abl融合基因的表达及其对K562细胞增殖和分化的影响

摘要

目的：构建bcr-abl融合基因的RNAi载体,并研究其转染在K562细胞中的干涉功能。
　　 方法：针对bcr-abl融合基因构建三个不同靶位点的RNAi载体,同时构建一对组成相同、序列无同源性阴性对照和针对GAPDH的阳性对照载体,载体同时携带新霉素抗性和GFP及RFP用于筛选转基因细胞和判断转染效率。
　　 (1)采用脂质体介导法将载体DNA转染到慢粒白血病细胞系K562中,经新霉素G418和荧光标志筛选阳性克隆。
　　 (2)RT-PCR检测转染后bcr-abl融合基因在K562细胞中mRNA的表达量；
　　 (3)联苯胺染色法检测经RNA干涉后的转基因细胞向红系分化的情况；
　　 (4)台盼蓝染色法检测经RNA干涉后筛选15天的转基因细胞对阿糖胞苷、a-干扰素及阿糖胞苷联合a-干扰素的敏感性。
　　 结果：
　　 (1)采用脂质体介导法转染48h后在激光共聚焦显微镜下观察荧光细胞达到40％,经G418筛选15天后荧光细胞达到95％。
　　 (2)RT-PCR结果显示:与对照组比较,RNA干扰三个靶位点的。bcr-abl融合基因在mRNA水平上表达量明显降低,其中靶位点2的抑制作用最显著；
　　 (3)联苯胺染色法显示K562细胞向红系分化的细胞联苯胺阳性率分别为RNA干涉48小时后靶点1、2、3与对照组相比分别由(3.80±0.40)％增加到(18.20±2.62)％、(33.33±2.45)％、(16.53±1.14)％,15天后的转基因细胞与对照组比分别由(3.80±0.60)％增加到(53.07±1.30)％、(61.87±21.22)％、(45.13±2.41)％(P<0.05)；
　　 (4)台盼蓝据染实验表明阿糖胞苷、a-干扰素对K562细胞的抑制作用呈浓度依赖性,浓度越大抑制作用越强；RNA干扰组K562细胞对阿糖胞苷、a-干扰素以及阿糖胞苷联合a-干扰素敏感性较未干涉组增高,具有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：三个不同靶点的RNAi载体均可以显著有效的抑制K562细胞中bcr-abl融合基因中mRNA的表达,纠正细胞的恶性表型诱导慢粒细胞向成熟分化,并且可以提高慢粒细胞对阿糖胞苷和a-干扰素的药物敏感性。