双启动子质粒pCN-SSIE的构建及作为DNA疫苗的免疫原性检测

摘要

龋病是最常见的疾病之一，WHO2002～2003年度公布的最新资料显示，虽然发达国家在近30年来龋病的发病率一直处于下降趋势，但是在一些发展中国家，龋病仍呈上升趋势，龋病的防治任务是非常艰巨的。研制一种高效廉价的防龋疫苗是较为符合当前我国国情的一种防治方法。由于变形链球菌具有很强的向牙面粘附聚集和代谢糖分产酸耐酸的能力，它被认为是最重要的致龋菌。变形链球菌的表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(AgⅠ/Ⅱ)是其重要的毒力因子，在细菌向牙面粘附的过程中发挥重要的作用。为了减少由于变形链球菌与人体存在交叉抗原而导致的疫苗的副作用，我们选择了表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ上靠近N端的一段与粘附密切相关的多肽片段——唾液结合区段(Saliva-bindingregion，SBR)作为抗原。本实验利用基因工程技术，构建含有编码变形链球菌致龋毒力因子SBR基因的双启动子防龋DNA疫苗pCN-SSIE，以减毒沙门氏菌为载体以诱导高效的粘膜免疫反应。 实验中，我们首先通过PCR扩增SBR基因和增强型绿色荧光蛋白(enhencedgreenfluorescenceprotein，EGFP)基因，并利用PCR在两段基因的两端添加合适的酶切位点。利用定向克隆技术将SBR基因插入到双启动子表达载体pCMVnir中，然后在SBR基因上游5'端融合一段人工合成的tPA信号肽基因序列。SBR基因下游依次插入核糖体内部进入位点(internalribozymeentrysite，IRES)基因和EGFP基因，构建质粒pCN-SSIE。通过DNA测序和酶切分析证明双启动子表达质粒pCN-SSIE构建成功后，再用该质粒转化减毒沙门氏菌SL3261和转染CHO细胞，通过观察绿色荧光标记蛋白的表达和Western杂交方法检测SBR蛋白在原核细胞和真核细胞中的体外表达情况。用pCN-SSIE质粒通过肌内注射免疫小鼠，检测其血清中的抗SBR特异性IgG抗体，以检测质粒在体内的表达情况。最后利用携带质粒pCN-SSIE的减毒沙门氏菌口服免疫小鼠，检测小鼠血清和唾液中抗SBR的特异性抗体IgG和IgA的产生情况。 DNA测序和限制性核酸内切酶酶切图谱分析均证明，构建的双启动子表达质粒pCN-SSIE插入序列正确，开放读码框架无误，质粒构建成功。在体外实验中，无论在原核细菌和真核细胞中都观测到了绿色荧光蛋白的表达，同时Western杂交也检测到了SBR蛋白的表达，说明质粒在原核和真核细胞中都能正常表达。在肌注免疫小鼠的血清中检测到了高水平的抗SBR特异IgG，说明质粒在体内也能较好的表达，同时还具有良好的免疫原性。在以减毒沙门氏菌为载体口服免疫小鼠的血清、唾液和引导分泌物中，均检测到了抗SBR特异性IgG和IgA水平的明显升高。 本实验通过基因工程技术，构建出了一个新的特别适合以减毒沙门氏菌为载体的DNA疫苗pCN-SSIE。它在真核和原核细胞中均能够良好表达，诱导机体产生免疫反应，特别是提高了机体粘膜免疫系统的体液免疫反应。

目录

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前 言

材料和方法

实验结果

讨 论

附图及附表

参考文献

致 谢

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