胰岛素-低分子季铵化壳聚糖复合物的制备、理化性质及其生物活性研究

摘要

胰岛素(Insulin，Ins)作为治疗糖尿病的首选药物，临床应用已有70多年的历史。由于胰岛素是多肽类药物，易被胃肠道蛋白酶水解破坏，因而口服无效，所以，临床多年来一直是通过注射给药。但长期频繁使用注射液也会对患者产生诸多不良反应，如过敏、组织纤维化等，这给患者带来了极大的身体、心理和经济负担。因此，研究非注射用胰岛素及其制剂是当今国内外医药界共同关注的课题。 本课题选择LTMC，利用静电作用对胰岛素的结构进行修饰，制备非注射用胰岛素。该修饰条件温和，工艺简单，产率高，修饰后的胰岛素生物活性不受影响。用LTMC作为胰岛素修饰剂，可起到保护胰岛素和促进胰岛素吸收的作用。另外，本文通过舌下和口服给药研究证实其降血糖效果显著。因此，经修饰的胰岛素适用于非注射给药及其制剂的研究。 本课题研究内容、方法及结果主要有以下几个方面。 1LTMC的制备及理化性质 在前期研究工作的基础上，对制备LTMC的部分工艺进行了改进，由CTS制备LTMC，并对其理化性质进行测定。工艺改进后制备的LTMC样品，其黏均分子量约为7KDa，季铵化度为46.64％，分子量分布均一，而且纯度较高，并通过紫外和红外初步确定了LTMC的季铵基团及其特征。 2Ins-LTMC制备工艺研究根据质量比，利用结合沉淀法筛选制备Ins-LTMC的Ins及LTMC的用量和最佳pH等，并通过正交试验设计研究温度、时间和溶液体积对Ins-LTMC制备的影响。初步确定了生产工艺路线，即在pH6.5溶液中，LTMC的用量为Ins的1～1.25倍，4℃条件下结合反应8小时。 3Ins-LTMC理化性质 本文采用物理和化学的方法研究Ins-LTMC理化性质。Ins-LTMC为白色或类白色粉末，易溶于无机酸或碱性水溶液，Ins-LTMC中LTMC的含量约为53％，胰岛素含量约为47％，等电点为6.29，分子量分布较均一，纯度较高，并保持Ins较好结构及其生物活性。胰岛素经修饰后理化性质稳定，除等电点改变外，其结构和性质基本无改变。 4Ins-LTMC生物效价 本试验参照中国药典2000版中胰岛素效价测定方法及生物检定统计法中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差。结果Ins-LTMC效价为12.386U/mg，可信限率为FL％=8.5454％，符合药典规定(不大于25％)。本试验测定的Ins-LTMC效价与估计效价相当，说明该修饰方法对胰岛素的活性影响较小。5Ins-LTMC舌下给药降血糖效果 本试验通过家兔舌下给药，研究几种不同Ins修饰物的降糖效果，并计算Ins-LTMC的相对生物利用度。结果各样品组的降糖效果虽然不同，但与空白对照组和胰岛素组比较均有非常显著性差异(P＜0.01)；其中Ins-LTMC(M=7KDa，QD％=46.6％)组的降糖效果与皮下注射胰岛素组比较无显著性差异(P＞0.05)，其最大降糖效应出现在60分钟左右，血糖值最大下降59.83％，相对生物利用度达到52.53％。因此，本试验证实Ins-LTMC经舌下给药具有较好的降糖效果，可用于非注射给药，更适合于患者餐后血糖的控制。 6Ins-LTMC口服降糖效果及LTMC对胰蛋白酶活性的影响 主要研究了小鼠口服Ins-LTMC的降糖效果，并与口服胰岛素对照组比较，结果二者的降糖效果具有非常显著性差异(P＜0.001)。给药120分钟后血糖值下降21.03％±6.57％，说明经修饰后的胰岛素在胃肠内的稳定性和吸收性能显著增加。另外，通过体外胰蛋白酶效价的测定研究了不同浓度的LTMC对胰蛋白酶活性的影响，结果LTMC对胰蛋白酶的活性没有影响。因此推测，Ins经LTMC修饰后有可能阻碍了胰蛋白酶与胰岛素的接触而起到一种保护作用。 本项研究内容目前国内外未见报道。本文采用LTMC对Ins的结构进行修饰实属首次，其修饰方法可行，产品质量稳定，经两种非注射给药研究均显示较理想的降血糖效果。研究首次采用高效层析技术对胰岛素及其修饰物进行测定，并建立了Ins-LTMC定性和定量方法。该项研究首先为非注射用胰岛素及其制剂的研究提供了理论依据，生产工艺及检测方法，因此该项研究既有科学的理论意义，又有较好的应用前景。

目录

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符号说明

摘要

第一章前言

第二章LTMC的制备及理化性质研究

第三章Ins-LTMC的制备工艺研究

第四章Ins-LTMC理化性质的研究

第五章Ins-LTMC的生物效价测定

第六章Ins-LTMC舌下给药降糖效果的研究

第七章Ins-LTMC口服降糖效果研究及LTMC对胰蛋白酶活性的影响

第八章课题总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文