蓖麻毒蛋白A链基因的克隆及重复表达载体的构建

摘要

蓖麻是世界十大油料作物之一，具有较高的经济价值与市场地位，被广泛应用于化工、航空、航天、机械等多个领域。蓖麻籽中存在着毒性物质，限制了蓖麻的综合开发利用。蓖麻含有的毒性物质中，以蓖麻毒蛋白毒性最强，它由A、B两条链组成，其中A链为效应链。利用分子生物学技术，抑制蓖麻蛋白A链基因的表达，为培育蓖麻无毒转基因植株奠定基础，对蓖麻无毒品种培育、提高蓖麻饲用价值及拓宽蓖麻综合利用途径有重要意义。 1.根据基因Genebank中发布的RTA基因序列，分别设计4对特异性引物，在两端分别插入不同的酶切位点。降落PCR法扩增蓖麻毒蛋白A链基因，纯化RTA-S1，RTA-S2，RTA-AS1、RTA-AS2片段，连接克隆质粒pGEM T-easy，转化大肠杆菌JM109，经菌落PCR及质粒酶切鉴定正确的阳性克隆做序列测定。测序结果显示，得到的基因片段与源序列高度同源，同源性分别为94％、94％、98％、98％。 2.将序列分析正确的阳性克隆提取质粒，分别酶切回收RTA-S1、RTA-S2及质粒载体pBI-121大片段，采用一步法连接，成功构建RTA基因正向重复表达载体pBI-RTA-S1-S2；提取质粒成功导入到农杆菌LBA4404中： 3.采用相同方法构建RTA基因反向重复表达载体，并将其导入到农杆菌中。

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第一章 文献综述

1.1蓖麻概述

1.2蓖麻综合利用价值

1.2.1蓖麻的药用价值

1.2.2蓖麻在生物农药产品研发上的利用

1.2.3蓖麻在化工产品研发上的利用

1.2.4蓖麻饼粕的饲用价值

1.3蓖麻的研究进展

1.3.1蓖麻栽培技术研究

1.3.2蓖麻生理生化研究

1.3.3蓖麻传统育种研究

1.3.4蓖麻分子育种研究

1.4蓖麻饼粕中的有毒成分及其毒性

1.4.1蓖麻毒蛋白

1.4.2蓖麻碱

1.4.3变应原

1.4.4血球凝集素

1.5蓖麻饼粕的脱毒

1.5.1化学法

1.5.2物理法

1.5.3微生物发酵法

1.5.4联合法

1.6基因沉默与植物共抑制技术

1.6.1共抑制机制

1.6.2正义超表达转基因RNA沉默的诱导模式

1.7本研究的目的及意义

第二章 蓖麻RTA基因的克隆及序列测定

2.1实验材料

2.1.1实验材料、菌种、质粒

2.1.2试剂

2.1.3细菌培养基

2.1.4仪器设备

2.2实验方法

2.2.1蓖麻基因组DNA的提取

2.2.1 RTA基因的引物设计

2.2.2目的基因的PCR扩增

2.2.4 PCR扩增特异目的片段的纯化回收

2.2.5目的片段与载体连接

2.2.6大肠杆菌感受态的制备

2.2.7连接产物转化感受态细胞

2.2.8重组质粒的筛选、检测

2.2.9克隆序列的测定

2.3结果与分析

2.3.1蓖麻毒蛋白基因组DNA的提取

2.3.2目的基因的PCR扩增

2.3.3重组质粒的鉴定

2.3.4克隆序列的测定与分析

2.4讨论

2.4.1蓖麻毒蛋白毒性探讨及共抑制可行性分析

2.4.2蓖麻毒蛋白A链基因序列分析

第三章 RTA基因正、反向重复表达载体的构建及对农杆菌的转化

3.1实验材料

3.1.1菌株、质粒

3.1.2试剂

3.1.3细菌培养基

3.2实验方法

3.2.1表达载体 pBI-121用PstI限制性内切酶酶切验证

3.2.2 pBI-121载体大片段酶切回收

3.2.3 RTA基因正向重复表达载体pBI-RTA-S1-S2的构建

3.2.4 RTA基因反向重复表达载体pBI-RTA-AS1-AS2的构建

3.2.3 RTA基因正、反向重复表达载体转化农杆菌

3.3结果与分析

3.3.1 pBI-121载体的酶切鉴定

3.3.2 XbaI、SmaI对pBI-121载体的双酶切

3.3.3正向重复表达载体pBI-RTA-S1-S2的构建

3.3.4反向重复表达载体pBI-RTA-AS1-AS2的构建

3.3.5 RTA基因正、反向重复表达载体转化农杆菌

3.4讨论

3.4.1植物个体研究RNA干扰载体中片断大小的选择

3.4.2干扰序列位置的选择

3.4.3一步法连接讨论

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介