粘细菌纤维堆囊菌降解纤维素多酶复合体的确证和性质分析

摘要

粘细菌是一类特殊的革兰氏阴性杆菌，能够进行滑行运动，具有复杂的多细胞行为和形态发生过程，是一类“生活在真核生物边缘”的高等的原核生物类群；产生众多结构新颖、作用机制独特的生物活性次级代谢产物是粘细菌的另一重要特征。根据“食性”的差异可将粘细菌简单的划分为溶细菌和溶纤维素两个生理类群。溶纤维素群中只有堆囊菌属一个属，纤维堆囊菌是其中的模式种。作为重要的微生物药物(例如著名的埃博霉素)产生菌，纤维堆囊菌逐渐引起全球的广泛关注。但是，对其最为基本的微生物学特性——粘细菌中唯一能够降解纤维素、半纤维素等生物大分子的类群，相关研究则涉及很少。本文利用实验室所建立的国内最大的粘细菌资源库的优势，对纤维堆囊菌降解纤维素的基本性质及相关酶类进行了研究。 纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，对纤维素的降解基本上是由微生物完成的。不同微生物降解纤维素时所采取的策略也不尽相同，主要表现在各种降解酶类的作用机制和组织形式上。纤维堆囊菌能够在以纤维素为唯一碳源的简单无机盐培养基(如CNST培养基)上生长，可产生多种纤维素和半纤维素酶类。所以，我们从表征其纤维素酶类的基本性质出发，开展了相关研究。广泛选取了13株纤维堆囊菌作为研究对象，对其在不同纤维素底物上的生长形态、降解纤维素特征、分化发育能力以及多种纤维素和半纤维素酶类的产生时间进行了测定和比较。通过对各菌株在滤纸纤维素底物上生长和子实体形成情况的分析，我们将其总结为两种不同的类型：一种类型是以接种点为中心，先向四周快速扩展，在扩展过程中伴随着滤纸纤维素的降解，达到一定程度以后，整个菌落的细胞同时开始聚集，并形成子实体结构，其子实体基本在生长同一时期形成，并布满整个菌落，这种类型的特点就是几乎所有的菌体细胞都处于相同的生长时期，细胞生长和分化发育具有一定的同步性；另一种类型是在菌落外围菌体细胞仍在增殖扩展时，靠近中心部位的菌体则已开始聚集和进入分化发育阶段，首先形成子实体结构，随着培养时间的延长，外围细胞也逐渐形成子实体结构，其子实体最终布满菌落中心部位或整个菌落，这种类型的特点就是菌落中不同部位的细胞所处的生长时期并不完全一致，从中心到外围具有不规则的阶梯性。纤维堆囊菌对于其它纤维素类底物也表现出了良好的降解能力。13株菌株都可以在羧甲基纤维素(CMC)和木聚糖平板上生长，经刚果红染色形成透明的降解圈：部分菌株还可在木聚糖和微晶纤维素平板上形成大型菌膜。酶活性分析表明，纤维堆囊菌的纤维素酶类是与细胞和纤维素底物相结合的，但酶活性偏低，与其快速降解纤维素的能力不相符。同时发现各种酶的活性不仅总体变化趋势比较相似，而且在时间上也有较强的同步性。在对纤维堆囊菌降解纤维素大分子的性质有了基本认知后，我们选择Sorangium cellulosum S09733-1作为后续实验的模式材料。 首先，我们对S09733-1在滤纸纤维上的细胞行为进行了表征。通过扫描电子显微镜观察发现，在菌体的生长阶段，只有与菌体接触到的纤维才能够被降解，而且处于此阶段的菌体表面产生了一种疣状突起结构；在生长后期细胞发生聚集并开始分化发育过程时，伴随纤维素降解的停止此结构消失。我们推测此种突起结构可能与纤维素降解相关。 然后，对S09733-1的纤维素酶系进行了分离纯化。利用两步抽提法和凝胶层析技术，我们得到了一个分子量在1000-2000KDa之间、具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶等多种酶活力的高分子量组份。经SDS-PAGE和HPLC分析，进一步确定此高分子量组份分子量范围在1500-2000KDa之间，由10个以上的蛋白组成，具有多种不同的纤维素降解酶活，初步证实了纤维堆囊菌中可能存在一类降解纤维素的多酶复合体。为了进一步证实这一结论，我们采取了两条基本思路：一是从单一酶组分出发，克隆并异源表达复合体中的一个酶组分，以此作为探针，对复合体进行细胞定位，并揭示其与细胞表面突起结构的关系；另一思路是对于复合体中所有蛋白组分进行分析和鉴定，在阐明其基本功能的基础上，揭示复合体的结构组织模式。 本实验室在前期工作中，利用各种纤维素、半纤维素降解酶类基因设计引物对S09733-1基因组进行了PCR扩增，但是由于纤维堆囊菌与其它纤维素降解微生物的低同源性，我们只获得了几个木聚糖酶基因。考虑到复合体中表现出了较高的木聚糖酶活性，我们选取了其中一个木聚糖酶的催化域(糖苷水解酶第10家族)编码片段xynF，将之插入表达载体pET-22b(+)，在受体菌株Ecoli BL21(DE3)中进行异源表达。重组蛋白XynF在胞内形成包涵体。经包涵体提取并利用其带有的组氨酸标签用Ni2<'2+>柱的方法进行了分离纯化。以纯化的重组蛋白XynF为抗原进行抗体制备，获得了效价为1：16的多克隆抗体。以此多克隆抗体为一抗，进行了S09733-l降解纤维素多酶复合体的免疫印迹分析。结果显示，该多克隆抗体不仅可以与XynF发生强烈结合，还可以与本实验室得到的S09733-1中另两个完整木聚糖酶基因异源表达蛋白XynA和XynB发生交叉反应，因为其催化结构域同属于糖苷水解酶第10家族(F／10)。对S09733-1木聚糖酶基因xynA和xynB所编码的氨基酸序列进行比对和3D结构预测发现，两个蛋白都只有两个结构域，一个为F／10家族催化域，另一个为一疏水结构域，功能未知。此种结构与纤维小体中的组成酶类有一定的相似之处。在对SDS．PAGE后的复合体进行免疫印迹分析时，出现三条杂交条带，说明在此酶复合体中至少存在三种具有F／IO家族催化域的木聚糖酶。 通过间接免疫荧光实验，对复合体的细胞分布进行了定位，结果表明： (1)对数生长期的S09733-1菌体细胞表面可发出绿色荧光，表明其复合体存在于对数生长期细胞表面并与细胞结合； (2)菌体细胞表面的荧光并不是均匀分布的，这与利用扫描电镜在菌体细胞表面观察到的突起结构相吻合； (3)当S09733-1菌体聚集和形成子实体后，聚集后的细胞和成熟子实体内的粘孢子都未检测到荧光信号，表明该时期的细胞表面已不存在相关的降解酶类。 (4)由于培养使用的M26培养基中不含有纤维素成分，表明S09733-1的纤维素降解酶类可能是组成型表达。 利用蛋白质组学的研究思路，运用双向凝胶电泳技术对S09733-1降解纤维素多酶复合体的组成进行了分析。双向电泳(17cmxl7cm的聚丙烯酰胺凝胶)分离结果显示，复合体呈现出30-40个清晰的蛋白点，分子量从10KDa到IOOKDa以上，等电点主要集中在偏酸性范围，偏碱性区域蛋白点很少。这一结果证实了复合体是由多个不同类型的蛋白组分构成，呈现出组分的多样性。将其中30个蛋白点进行抠点和胶内酶解，用MALDI-TOF MS技术对其进行了肽质量指纹图谱(PMF)分析，得到了21个有意义的质谱图谱，其中1个蛋白组分被初步鉴定为内切葡聚糖酶。由于堆囊菌的特殊性，其他20个蛋白样品没有检索到完全可信的结果，但在其各自的匹配蛋白列表中，有多种纤维素降解相关的酶类处于相对较高的得分。所以，我们正在进行的工作是希望通过串联质谱技术得到蛋白点的肽段序列信息，通过序列检索或者结合分子生物学方法对相应蛋白质进行准确的鉴定。 本文的结果不但首次对于纤维堆囊菌降解纤维素类物质的基本特性进行了较为全面的表征，而且证明了其纤维素降解酶类以一种高效的多酶复合体形式分布于细胞表面，履行相关的功能。这是首次在好氧细菌中发现类似的降解酶类组织形式存在，突破了纤维素酶复合体的厌氧界限，具有重要的理论意义。

目录

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摘要

缩略词表

第一章文献综述

第二章纤维堆囊菌菌株的形态观察及降解纤维素性质分析

第三章纤维堆囊菌So9733-1降解纤维素多酶复合体的分离纯化和初步确定

第四章纤维堆囊菌So9733-1降解纤维素多酶复合体的细胞定位分析

第五童纤维堆囊菌So9733-1降解纤维素多酶复合体组成的初步分析

总结与展望

附录

参考文献

致谢

在读博士期间发表的论文