LMWH对人脐静脉内皮细胞分泌功能和细胞周期的影响

摘要

目的：广泛的血管内皮细胞的激活、功能障碍和结构损伤是妊娠期高血压疾病发病机理的一个中心环节。内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)和内皮素(ET)可作为反映其功能的指标。子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种，研究表明，NO和ET的变化与子痫前期的发生密切相关。低分子肝素(LMWH)已经较广泛应用于临床，但对于其非抗凝机制方面的应用，国内外研究较少。本课题用子痫前期患者及正常晚孕妇女的血清与人脐静脉内皮细胞ECV304细胞株在体外共培养，然后用LMWH进行干预治疗，利用实时荧光定量RT-PCR、免疫组化、流式细胞技术等方法，检测内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、ET及细胞周期的变化，旨在为LMWH治疗妊娠期高血压疾病提供实验和理论依据。 方法：研究对象分为两组：子痫前期患者组18例，对照组为正常晚期妊娠妇女12例。两组孕妇于入院后(子痫前期患者于药物治疗前)采空腹肘静脉血5m1，离心后收集血清备用。将人脐静脉内皮细胞株ECV304分3次接种于15个6孔培养板(预先放入经过处理的无菌盖玻片)，每3孔加入含20％同一份妇女血清的培养液，在37℃，5％CO<,2>条件下共同孵育48小时后，把用相同血清培养后的ECV304按随机原则给予以下3种处理：两孔加入LMWH，使其终浓度分别为1U/ml和2U/ml；另1孔加入等体积的培养液。继续孵育24小时后，取出盖玻片行免疫组化，检测内皮细胞ET表达的变化，用胰蛋白酶消化法收集内皮细胞，分别运用RT-PCR法及流式细胞术检测内皮细胞eNOS-mRNA的表达与细胞周期的变化。 结果：①子痫前期患者血清培养后，内皮细胞eNOS-mRNA的表达明显降低(P<0.05)，ET表达明显增高(P<0.05)。内皮细胞受患者血清刺激后，G<,1>期进入S期和G<,2>期的细胞百分比减少，G<,1>期细胞百分数增多(P<0.05)，S期和G<,2>期细胞均减少(P<0.05)。②LMwH干预后，无论是正常血清组还是患者血清组，内皮细胞eNOS-mRNA表达均明显增强，并且不同浓度间有显著性差异，呈剂量依赖性。正常血清组中，高浓度LMwH更能显著增加内皮细胞对eNOS-mRNA的表达(P<0.01)；患者血清组中，高浓度LMWH也比低浓度LMWH使eNOS-mRNA增加明显(P<0.05)。低浓度LMWH时，正常血清组和患者血清组内皮细胞表达eNOS-mRNA的水平无明显差异(P>0.05)；高浓度LMWH时，其表达的eNOS-mRNA有差异，并且正常血清组增加更显著，(P<0.05)。③LMWH干预后，对内皮细胞ET的表达无明显差异，且不同浓度间亦无差异(P>0.05)。④LMWH对内皮细胞各周期也有一定的影响。LMWH使患者血清组G<,1>期进入S期和G<,2>期的细胞百分比增加(P<0.05)，但不同浓度间差异无统计学意义(P>0.05)；正常血清组中，细胞周期无明显变化(P>0.05)。 结论：①子痫前期患者血清可降低体外培养的内皮细胞eNOS-mRNA的表达，增加ET表达，减少S期和G<,2>期的细胞百分比。②LMWH干预后，用正常晚孕妇女和患者血清培养的内皮细胞eNOS-mRNA表达均升高，并呈剂量依赖性，且在高浓度LMWH时，正常血清组内皮细胞对eNOS-mRNA的表达增加更明显；LMWH干预后，ET的表达无显著性差异；但结合LMWH能增加患者血清组内皮细胞S期和G<,2>期的细胞百分数，推测LMWH能抑制子痫前期患者血清组内皮细胞对ET的表达。③本研究提示LMWH能调节内皮细胞对eNOS的分泌，并在一定程度上调节患者血清培养的内皮细胞周期。由此推断，LMWH可能通过调整NO/ET平衡及影响内皮细胞周期而对妊娠期高血压疾病具有治疗和预防作用。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

图表

参考文献

附文献综述低分子肝素对胎儿生长受限的治疗作用

致谢