小麦Mlo基因RNAi表达载体的构建和反义表达植株后代的分子检测

摘要

小麦白粉病是由专性寄生真菌一小麦白粉菌(ErysiPe graminisf.sp．Tritici) 引起的一种全球性危害小麦的严重病害，对小麦的产量和品质有着极大的影响。施用农药虽然能在一定程度上减轻病害，但却严重危害生态环境和产品。白粉菌生理小种众多，变异速度很快，常规育种获得的小麦抗性品种往往因为白粉菌生 理小种的变异而失去抗性，这就大大缩短了品种的使用年限，因此利用基因工程 方法选育广谱抗白粉病品种可能是最为经济和有效的方法。研究表明大麦讹基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有已知大麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.hrdei)生理小种产生持久、广谱的抗病性。小麦是大麦的近缘种，而目二者的Mlo基因的cDNA有92％的同源性，因而它们有着相似的作用机制。本实验室已获得小麦Mlo基因cDNA片段(长1434bp)，所以可以通过RNAi技术或 者反义技术关闭或者减弱植物本身Mlo基因的表达，赋予植物抗病性。RNAi是一种抑制基因表达的技术手段，所具有的特异性、稳定性、高效、快速等特性为研究未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段，在应用研究中也发挥着越来越重要的作用。本研究分别在小麦Mlo基因cDNA片段(1434bp)编码区的5’和3’(对应于小麦ML0蛋白的N端和C端)选择抑制效率较高的部分，构建了植物RNAi表达载体pRI-Nmlo和pRI-Cmlo，并转化了小麦优质品种烟优361。 我们还对小麦Mlo基因eDNA片段的反义表达载体pRAL-anti-mlo转基因T<,0>、T<,1>,T<,2>代植株进行了分子检测。从生物安全性的角度考虑，我们所使用的植物表达载体不含选择标记基因，所以不能通过抗生素或者除草剂进行筛选，而只能运用分子检测和表型鉴定来选择转基因阳性植株。由于我们使用小麦Mlo基因cDNA片段，理论上应该可以与植株内源的含内含子的基因组序列相互区分，但是小麦是异源六倍体，基因组情况比较复杂，推测可能含有多个Mlo同源基因，构成一个基因家族，这种基因组背景的复杂性为转基因的检测带来不少的困难，经过摸索，采用巢式PCR的方法进行柃测。 根据PCR检测的结果，在To代植株中，以核生3号为受体的转化率为6.7％，烟2801为6.3％，平均为6.6％。由于农杆菌介导的苗端转化法不能保证所有茎尖分生组织均被转化，To代有可能是嵌合体，因此To代的检测并不十分可靠，需要对其后代进行鉴定才能确定目的基因是否转入。T<,1>代植株中，根据株系所计算的转化率分别为：核生3号的转化率为19.2％，烟2801为15.8％，平均为18.1％。这也说明To代的转化体确实可遗传到T<,1>代。转基因植株对白粉病的抗性比对照明显增强，部分高抗白粉病的植株正在选择纯合体，对T<,2>代转基因植株的进一步检测还在继续进行中。 上述工作为建立农杆菌介导的苗端转化法奠定了良好的基础，为获得优质、高产、抗白粉病的转基因小麦创造了条件。

目录

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摘要

符号说明

第一部分综述：植物抗病分子生物学及抗病基因工程

第二部分研究工作 引言

第二部分研究工作 材料与方法

第二部分研究工作 结果与分析

第二部分研究工作 讨论

参考文献

致谢

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