类风湿关节炎，强直性脊柱炎和骨关节炎滑膜成纤维样细胞增殖与分化的体外研究

摘要

第一部分： 目的：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是主要表现为周围对称性多关节慢性炎症的自身免疫性疾病。类风湿关节炎的基本病理变化为滑膜炎。滑膜成纤维样细胞(FLS)过度增生，大量T淋巴细胞和巨噬细胞浸润，以及血管翳的形成。异常增生的FLS分泌基质蛋白酶和致炎性细胞因子，促发炎症和免疫反应，是导致软骨和骨质的破坏的主要因素。抑制FLS的异常增殖或诱导FLS分化成熟是治疗RA的重要策略。 沙利度胺(Thalidomide)是TNF-α抑制剂和血管生成抑制剂，具有较强的抗炎作用，近年已作为免疫调节剂应用于RA等风湿性疾病。白芍总苷(totalglucosides of peony，TGP)是从中国传统的中草药白芍根部中提取的有效成分，具有机能和剂量依赖性的免疫调节作用。基础和临床研究证实，沙利度胺和TGP对类风湿关节炎有一定疗效，改善临床症状。艾拉莫德(Iguratimod，T-614)为一种甲磺酰胺基非甾体类抗炎药(NSAIDs)，是COX-2选择性抑制剂，国外研究表明其对RA患者有一定免疫抑制作用。全反式维甲酸(ATRA)、l，25(0H)<,2>D<,3>、地塞米松是已知的细胞分化诱导剂，可促进成纤维细胞的分化成熟，抑制其无限增殖特性，被广泛用于治疗皮肤、肝脏、肺脏纤维化，降低纤维组织增生，但它们对RA的滑膜成纤维细胞增殖影响却鲜有报道。本试验旨在观察RA滑膜FLS的生长特点，研究沙利度胺、TGP、T-614，ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、和地塞米松在体外实验中对RA-FLS细胞增殖分化特性的影响，将更全面地揭示RA的发病机制，探讨免疫调节药物的不同作用方式，验证其临床疗效，寻找治疗RA新途径。 方法：1．组织来源：滑膜组织关节镜诊断治疗术、关节活检针抽取滑膜组织和抽取关节积液培养。收集膝OA(8例)和RA(5例)，RA和OA患者的诊断均符合美国风湿病学会制订的分类标准。分离的滑膜组织经2倍体积的0.4％的胶原酶Ⅱ和等体积的0.25％胰蛋白酶消化分离并贴壁培养。 2．FLS的鉴定：滑膜细胞贴片，进行细胞染色(HE染色、成骨细胞碱性磷酸酶(AKP)染色、脂肪细胞苏丹-Ⅲ染色)和单克隆抗体的免疫组化染色 (Vimentin、FⅧ因子和CD68)。 应用流式细胞仪直接标记法(CDl4、CD44、HLA-DR、CDllb)和间接标记法(Fibronectin)检测细胞表面标记。 3．FLS增殖特性检测：在RA和OA的FLS中分别加入不同浓度Thalidomide、TGP、T-614、ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、和地塞米松稀释液共孵育。以FLS的10％NCS-DMEM培养液和5％(V/V)DMSO的FLS溶液为不加药的阳性对照(对照A和DMSO)。MTT比色测定法检测各孔吸光度，计算各种药物干预后的细胞存活分数(SF)。流式细胞仪和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别测定RA-FLS的细胞周期和c-fos、COX-2mRNA表达。 4．统计分析：应用SAS6.12进行数据分析，所有数据进行方差齐性检验。两组和三组比较采用t检验和方差分析(ANOVA)，每组数据进行相关回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。 结果：1．细胞鉴定：经细胞染色、免疫组化和流式细胞仪检测细胞标记检测发现细胞呈长梭状极向排列波形蛋白(Vimentin)染色阳性，纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)表达阳性，符合人关节滑膜成纤维样细胞特点。RA和OA患者滑膜细胞加入Thalidomide、TGP、T-614、ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、和地塞米松后细胞的表型未发生改变，没有出现FLS转化为其他类型细胞的现象。同时排除下列细胞：成骨细胞(AKP染色阴性)、脂肪细胞(苏丹-Ⅲ染色阴性)、滑膜巨噬样细胞或血巨噬样细胞(CD68染色阴性、CDl4<'->)、血管内皮细胞(FⅧ因子染色阴性)、树突状细胞(HLA-DR<'->、CDllb<'->)和间充质干细胞(CD44<'->)。 2．MTT法检测多种药物对各种FLS生长增殖的影响：RA和OA-FLS中分别加入Thalidomide、TGP和T-614①T-614、TGP和Thalidomide对RA和OA-FLS的SF值均有不同程度的抑制，显示各组SF值下降，与对照组A相比差异均有统计学意义(P<0.05)；②每个药物对RA和OA-FLS的作用进行比较发现：T-614、TGP和Thal idomide药物干预时对炎症关节RA-FLS细胞增殖率的抑制作用大于非炎症关节OA，RA-FLS对药物的反应敏感。(P<0.05)；③药物对二种FLS的影响比较：TGP和Thalidomide对RA、OA关节炎FLS的SF抑制率大于T-614，TNF-α抑制剂Thalidomide作用最明显。组间差异有统计学意义(p<0.01)；④对各组数据做相关分析，发现生理剂量范围内的Thalidomide和高剂量TGP干预时RA和OA组药物浓度与FLS的SF值负相关，呈现剂量依赖性的药物抑制曲线，并有统计学意义(p<0.05)。T-614对各组FLS的抑制作用未表现量效关系(p>0.05)。将ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、和地塞米松加入培养的RA-FLS，测定FLS的SF值变化情况：①ATRA、1,25(0H)<,2>D<,3>、和地塞米松对RA-FLS的SF值均有不同程度的抑制，各组SF值均下降，与对照组A相比差异均有统计学意义(p<0.05)；②1，25(oH)<,2>D<,3>、和地塞米松对RA-FLS的SF抑制率大于对OA-FLS的作用，组间差异有统计学意义(p<0.01)；③三药相比地塞米松对RA-FLS的增殖作用抑制最明显，其与ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、组RA-FLS的SF值比较，组间差异有统计学意义(p<0.01)；1，25(oH)<,2>D<,3>、对OA-FLS的抑制率低于ATRA和地塞米松作用于OA组，组间差异有统计学意义(p<0.01)；；④对各组数据做相关分析，发现地塞米松和1，25(OH)<,2>D<,3>、干预时RA、0A组SF抑制作用呈现剂量依赖性曲线，并有统计学意义(p<0.05)。ATRA对二组FLS的抑制作用未表现量效关系(p>0.05)。 3．流式细胞仪测定FLS的细胞周期及药物对细胞周期的影响：ATRA、地塞米松和1，25(0H)<,2>D<,3>、(高剂量、低剂量)加入培养的RA患者FLS作用5天，对FLS的细胞周期均有明显抑制作用，促进细胞分化，诱导RA-FLS细胞凋亡。表现为出现显著的凋亡峰、S期缩短,与OA和RA不加药对照组相比差异非常明显。 4．RT-PCR方法检测FLS的c-fos、COX-2表达：RA和OA-FLS的c-fos、COX-2mRNA表达率均很高。RA-FLS加入Thalidomide 1000mg/L共孵育3天后c-fos的表达率下降，并干扰COX-2mRNA表达。与不加药的RA-FLS和OA-FLS对照有明显差异。ATRA 10<'-5>mol/L加入RA-FLS孵育后，明显抑制c-fos的转录。 结论:1．培养和鉴定RA和OA的滑膜细胞，证实体外培养传代后的RA-FLS与OA-FLS相比，不仅组织学、免疫组化和细胞表面标记无明显差异，而且在无刺激因子的干预时，体外传代培养时的增殖特点、细胞周期等生长特性也无明显差别，均为非恶性无限制增生。 2．T-614、TGP和Thalidomide对炎症关节RA-FLS细胞增殖率的抑制作用大于非炎症关节OA。说明虽然没有诱导剂刺激时，RA-FLS的细胞增殖能力与非炎症关节无差别，但在免疫调节药物干预下，不同种类的FLS对药物的反应不一，滑膜增殖明显的RA，其FLS对药物和诱导剂更敏感。 3．在实验剂量下T-614、TGP和Tha-1idomide对RA和OA的FLS增殖能力、基因表达均有不同程度的抑制。其中TGP和Thalidomide对RAFLS的增殖分化、基因转录的调控作用影响甚于T-614；TNF-α抑制剂Thalidomide作用最明显，其抑制作用呈剂量依赖曲线。同时Thalidomide能抑制COX-2的表达，降低PGE<,2>合成减轻炎症反应，表明Thalidomide通过不同途径发挥对RA滑膜细胞增生的免疫调节作用。COX-2特异抑制剂T-614和中药提取物TGP对细胞增殖周期和基因转录有一定的免疫调节作用，但无剂量依赖曲线形成。T-614、TGP和Thalidomide对RA滑膜炎的免疫调节作用，是不依赖于MLS、T淋巴细胞和细胞因子等的介导，直接调控细胞生长和基因转录的。 4．细胞分化诱导剂ATRA、1，25(OH)<,2>D<,3>、和地塞米松在实验剂量时能明显降低RA-FLS的细胞增殖，促进细胞分化，诱导FLS凋亡，其中地塞米松对RA-FLS增殖的抑制作用最明显；ATRA还可抑制c-fos的转录。但在本实验条件下，未发现以上三种药物将分化较为成熟的FLS转化为其他类型细胞。 第二部分： 目的: 强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是以骶髂关节炎、肌腱附着点炎和和累及脊柱和外周关节炎为特征的一种风湿病，其外周关节病变过程中存在慢性滑膜炎，表现为炎症细胞浸润和滑膜组织增生。滑膜组织中的滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synOVial cells，FLS)在炎症关节中可增殖肥厚，在滑膜炎的发生发展中起重要作用。比较AS和非炎症性疾病骨关节炎(Osteoarthritis，OA)滑膜FLS的生长增殖特性及影响因素，对了解AS关节炎发病机制很有帮助。 艾拉莫德(IgUratimod，T-614)为一种甲磺酰胺基非甾体类抗炎药(NSAIDs)，是COX-2选择性抑制剂。白芍总苷(total gllJCOSides 0f peony，TGP)为从中国传统的中草药白芍根部中提取的有效成分，二者均可抑制关节炎的进展，具有免疫调节作用。沙利度胺(Thalidomide)是TNF-α抑制剂和血管生成抑制剂，近年作为新型的抗炎免疫调节剂应用于RA等风湿性疾病。研究者三中免疫调节剂对AS和0A滑膜FLS的生长分化的影响，将更全面地揭示AS发病机制，探讨药物的不同作用方式，验证其临床疗效。 方法：1．组织来源：共收集OA和AS各8例，其中滑膜组织膝关节置换术和关节镜诊断治疗术收集OA(8例)和AS(3例)的膝滑膜组织；抽取膝关节积液分离培养收集AS(5例)患者滑膜细胞，AS和0A患者的诊断均符合美国风湿病学会制订的分类标准。分离的滑膜组织经2倍体积的0.4％的胶原酶II和等体积的0.25％胰蛋白酶消化分离并贴壁培养。 2．FLS的鉴定：滑膜细胞贴片，进行细胞染色和单克隆抗体的免疫组化染色。应用流式细胞仪直接标记法和间接标记法检测细胞表面标记。 3．FLS增殖特性检测：在AS和oA的FLS中分别加入Thalidomide、TGP和T-614不同浓度的稀释液共孵育，以FLS的10％NCS-DMEM培养液为不加药的阳性对照(对照A)。MTT比色测定法检测各孔吸光度，计算各种药物干预后的细胞存活分数(SF)。流式细胞仪和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别测定OA和AS-FLS的细胞周期和c-fos、COX-2mRNA表达。 4．统计分析：所有数据进行方差齐性检验，两组和三组比较采用t检验和方差分析(ANOVA)，每组数据进行相关回归分析。P(0.05为差异有统计学意义。 结果: 1．细胞鉴定：经细胞染色、免疫组化和流式细胞仪检测细胞标记检测发现细胞呈长梭状极向排列，波形蛋白(Vimentin)染色阳性，纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)表达阳性，符合人关节滑膜成纤维样细胞特点。AS和0A患者滑膜细胞加入T-614、TGP和Thalidomide后细胞的表型未发生改变。 2．MTT法检测三种药物对AS-FLS生长的影响：AS和OA-FLS中分别加入T-614、TGP和Thal idomide，T-614、TGP和Thal idomi de对AS和OA-FLS的SF值均有不同程度的抑制，显示各组SF值下降，与对照组A相比差异有统计学意义(P<0.05)；T-614、TGP和Thalidomide药物干预时对AS-FLS细胞增殖率的抑制作用大于对OA-FLS(P<0.05)；TGP和Thalidomide对AS和OA-FLS的SF抑制率大于T-614，TNF-α抑制剂Thalidomide作用最明显，差异有统计学意义(P<0.01)；对各组数据做相关分析，发现生理剂量范围内的Thalidomide和高剂量TGP干预AS和OA组时，呈现剂量依赖性的药物抑制曲线，并有统计学意义(P<0.05)。T-614对各组FLS的抑制作用未表现量效关系(P>0.05)。 3．流式细胞仪测定药物对细胞周期的影响：T-614、TGP和Thalidomide三种药物不同剂量加入培养的OA和AS患者FLS培养液中，对FLS的细胞周期均有抑制作用。其中加入大剂量T-614时可诱导细胞凋亡，TGP和Thalidomide大剂量明显抑制有丝分裂，延长G<,1>期；三种药物中剂量可抑制细胞分裂，表现为G<,1>期延长而S期缩短；小剂量应用则对细胞周期的影响不大，与OA不加药对照组相比差异无统计学意义，药物对AS和OA-FLS细胞周期的影响差异无统计学意义。 4．RT-PCR方法检测FLS的c-fos、COX-2表达：AS-FLS的c-fos、COX-2 mRNA表达率均高于OA-FLS，药物对FLS转录的抑制作用在AS-FLS表现更明显。AS和OA-FLS力口入Thal idomide 5000mg/L、TGP 2000mg/L和T-614 1000mg/L共孵育3天后c-fos的表达率下降，三者中Thalidomide的抑制率最大，几乎完全抑制c-fos表达，T-614的作用最弱。Thalidomide 5000mg/L、T-614 1000mg/L和T-614 100mg/L干扰COX-2mRNA表达，1000mg/L T-614完全抑制COX-2表达，Thalidomide 5000mg/L、T-614 100mg/L也明显降低COX-2表达率，与不加药的对照有明显差异。 结论1．培养和鉴定AS和OA的滑膜细胞，证实体外培养传代后AS和OA的滑膜细胞，不仅组织学、免疫组化和细胞表面标记无明显差异，而且在无刺激因子的干预时，体外增殖特点也无明显差别，均为非恶性无限制增生。 2．在实验剂量下T-614、TGP和Thalidomide对AS和OA-FLS增殖能力、细胞有丝分裂均有不同程度的抑制；促进细胞分化并减少c-fos mRNA表达。T-614、TGP和Thalidomide对AS-FLS细胞增殖率的抑制作用大于对非炎症性关节病OA，说明在免疫调节药物干预下，不同种类的FLS细胞受抑制程度不同，AS滑膜细胞增殖越明显，对上述药物越敏感。 3．在实验的三种药物中，TGP和Thalidomide对AS-FLS增殖分化、基因转录的调控作用影响甚于T-614，Thalidomide作用最明显。Thalidomide还能抑制COX-2的表达，降低PGE<,2>合成减轻炎症反应，表明Thalidomide通过不同途径发挥其免疫调节作用。因此T-614、TGP和Thalidomide可以通过直接调控细胞生长和基因转录，对AS和OA关节滑膜炎具有免疫调节作用。这一发现作用丰富补充了免疫调节药物控制滑膜炎的不同作用方式。 第三部分： 目的：骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种老年人多发的关节疾病。OA存在滑膜炎并影响疾病的发生和进程，表现为炎症细胞浸润和滑膜组织增生。滑膜组织中的滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synovial cells，FLS)分泌透明质酸产生滑液和细胞因子，在炎症关节中可增殖肥大，在滑膜炎的发生发展中起重要作用。 沙利度胺(Thalidomide)是TNF-α抑制剂和血管生成抑制剂，近年作为新型的抗炎免疫调节剂应用于风湿性疾病。白芍总苷(total glucosides of peony，TGP)为从中国传统的中草药白芍根部中提取的有效成分，二者均可抑制关节炎的进展，具有免疫调节作角。艾拉莫德(Iguratimod，T-614)为一种甲磺酰胺基非甾体类抗炎药(NSAIDs)，是COX-2选择性抑制剂。 观察0A滑膜FLS的生长分化特点及这三种药物对他们的影响，将更全面地揭示疾病的发病机制，探讨免疫调节药物的不同作用方式，验证其临床疗效。 方法1．组织来源：滑膜组织膝关节置换术和关节镜诊断治疗术。收集膝OA(8例)和滑膜正常的对照(non-inflamedsynovium，NS)5例，OA患者的诊断均符合美国风湿病学会制订的分类标准。分离的滑膜组织经2倍体积的0.4％的胶原酶Ⅱ和等体积的0.25％胰蛋白酶消化分离并贴壁培养。 2．FLS的鉴定：滑膜细胞贴片，进行细胞染色(HE染色、成骨细胞碱性磷酸酶(AKP)染色、脂肪细胞苏丹一Ⅲ染色)和单克隆抗体的免疫组化染色(Vimentin、FⅧ因子和CD68)。应用流式细胞仪直接标记法(CDl4、CD44、HLA—DR、CDllb)和间接标记法(Fibronectin)检测细胞表面标记。 3．FLS增殖特性检测：在0A和正常对照者(NS)的FLS中分别加入Thalidomide、TGP和T一614不同浓度的稀释液共孵育。以FLS的10％NCS—DMEM培养液为不加药的阳性对照(对照A)，FLS中加入10％(V/V)DMSO的无水乙醇和DMSO分别为载体对照组(对照B和C)。MTT比色测定法检测各孔吸光度，计算各种药物干预后的细胞存活分数(SF)，再加大三种药物剂量范围，观察对OA—FLS增殖的抑制作用。流式细胞仪和反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)方法分别测定OA—FLS的细胞周期和c-fos、COX-2 mRNA表达。 4．统计分析：所有数据进行方差齐性检验。两组和三组比较采用t检验和方差分析(ANOVA)，每组数据进行相关回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。 结果1．细胞鉴定：经细胞染色、免疫组化和流式细胞仪检测细胞标记检测发现细胞呈长梭状极向排列，波形蛋白(Vimentin)染色阳性，纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)表达阳性，符合人关节滑膜成纤维样细胞特点。OA患者和Ns对照细胞加入Thalidomide、TGP和T-614后细胞的表型未发生改变。同时排除下列细胞：成骨细胞(AKP染色阴性)、脂肪细胞(苏丹-Ⅲ染色阴性)、滑膜巨噬样细胞或血巨噬样细胞(CD68染色阴性、CDl4<'->)、血管内皮细胞(FⅧ因子染色阴性)、树突状细胞(HLA-DR<'->、CDllb<'->)和间充质干细胞(CD44<'->)。 2．MTT、法检测三种药物对0A-FLS生长的影响：对来源于NS和0A的FLS，对照组A的SF为l，对照组B和C的SF值较A组差异P>0.05)；加入Thalidomide、TGP和T-614的各组SF值下降明显，与对照组A、B、C相比差异均有统计学意义(P<0.05)；Thalidomide和TGP对0A组抑制率高于NS(P<0. 05)，T-614对0A和NS组的抑制作用差异无统计学意义(P<0.05)：TGP和Thalidomide对OA-FLS的SF抑制率大于T-614，Thalidomide作用最明显，组间差异有统计学意义(p<0.01)；生理剂量范围内的Thalidomide和高剂量TGP干预时OA组药物浓度与FLS的SF值负相关，呈现剂量依赖性的药物抑制曲线，并有统计学意义(p<0.05)。T-614对各组FLS的抑制作用仍未表现量效关系(p>0.05)。 3．流式细胞仪测定FLS的细胞周期及药物对细胞周期的影响：Thalidomide、TGP和T-614三种药物不同剂量加入培养的OA患者FLS培养液中，对FLS的细胞周期均有抑制作用。其中加入大剂量T-614(1000mg/L)时可诱导细胞凋亡，Thalidomide 5000mg/L和TGP 2000mg/L明显抑制M期，延长G<,1>期；三种药物中剂量(Thalidomide 1000mg/L、TGP400m /L和T-614 200mg/L)延长G<,1>期而缩短S期；小剂量应用则对细胞周期的影响不大，与OA和NS不加药对照组相比差异无统计学意义 4．RT-PCR方法检测FLS的c-fos、COX-2表达：OA-FLS的c-fos、COX-2 mRNA表达率高。OA-FLS加入Thaiidomide 5000mg/L、TGP 2000mg/L和T-614 1000mg/L共孵育3天后c-fos的表达率下降，三者中Thalidomide的抑制率最大，几乎完全抑制c-fos表达，T-614的作用最弱。Thai idomide 5000mg/L、T-614 1000mg/L和T-614 100mg/L干扰COX-2 mRNA表达，1000mg/LT-614完全抑制COX-2表达，Thal idomide 5000mg/L、T-614 100mg/L也明显降低COX-2表达率，与不加药的OA对照有明显差异。 结论1．培养和鉴定OA的滑膜细胞，证实体外培养传代后的骨关节炎FLS与NS-FLS相比，不仅组织学、免疫组化和细胞表面标记无明显差异，而且在无刺激因子的干预时，体外传代培养时的OA和NS的FLS在体外培养时的增殖生长活性、分化能力的差异无统计学意义。 2．Thaiidomide、TGP对OA-FLS细胞增殖率的抑制作用大于NS，表明虽然在没有诱导剂刺激时，OA-FLS的细胞增殖能力与NS无差别，但OA和NS组的FLS对免疫调节药物Thalidomide和高浓度TGP的反应不一。 3．在实验剂量下Thalidomide、TGP和T-614对OA和NS的FLS增殖能力、细胞有丝分裂均有不同程度的抑制；促进细胞分化并减少c-fos mRNA表达。其中Thalidomide对OA和NS-FLS细胞活性的抑制率最大，加大药物剂量范围后Thalidomide和TGP的剂量与OA-FLS的SF值呈负相关。而Thalidomide能抑制COX-2的表达，表明Thalidomide通过不同途径发挥其免疫调节作用。作为COX一2特异性抑制剂，T-614和中药提取物TGP对细胞增殖周期和基因转录有一定的免疫调节作用。因此Thalidomide和TGP明显降低OA-FLS的增殖分化能力，可以探讨治疗OA滑膜炎。

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