动脉粥样硬化斑块中糜酶活性的实验研究

摘要

背景 冠心病和脑卒中是严重危害人类健康的常见病和多发病，其病理基础是动脉粥样硬化(AS)。大量证据表明，在AS的形成和发展过程中，内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等发挥了重要的作用。晚近的研究证实肥大细胞与AS的发生发展密切相关。肥大细胞通过分泌多种炎症介质，包括糜酶(chymase)、组胺和各种化学因子及细胞因子，诱导血管炎症反应、内皮功能失调、泡沫细胞形成、胞外基质降解和微血管新生等，对AS斑块的形成及斑块稳定性起着重要作用。其中，肥大细胞分泌的糜酶与AS病程进展关系尤为密切。综合研究表明，糜酶可能通过以下途径促进AS的形成和发展过程：(1)通过介导非经典途径激活血管组织中的肾素—血管紧张素系统(RAS)，引起血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)生成增加，促进AS病变的进展和斑块易损；(2)通过水解活化多种炎性因子，促进AS的炎症反应过程，加速AS的进展；(3)通过降解载脂蛋白AI(Apo-AI)，阻碍泡沫细胞的胆固醇外向转运，引起胞内脂质淤积，导致细胞坏死脂质沉积，促进AS斑块的形成和发展；(4)直接蛋白水解斑块纤维帽的基质成分，如：连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型胶原，导致纤维帽变薄，促进斑块向不稳定方向转变；(5)通过活化基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-3和MMP-9，导致斑块纤维帽的基质成分水解而影响斑块的稳定性；(6)通过活化多种炎性因子诱导斑块血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡并抑制其分泌活性，促进斑块纤维帽变薄，降低斑块稳定性等；(7)通过促进AngⅡ及内皮素-1(ET-1)等递质的分泌，增加血管病变局部的血流剪切力，促进AS斑块向不稳定方向发展。总之，糜酶在AS的发生和发展过程中发挥着极为重要的作用。 然而，目前糜酶活性的检测方法尚无统一标准。国际上较多采用组织提取物加入含AngⅠ的反应体系，采用反相高效液相色谱技术(HPLC)检测糜酶活性，但测量误差较大。国内学者采用改良的AngⅠ反应体系，应用三种抑制剂分别抑制糜酶以外的其它AngⅠ水解酶的活性，运用减法原则和放射免疫技术(RIA)检测AngⅠ水解活性，用来表示糜酶和ACE活性，理论上较为合理。但是无论液相色谱技术或是放射免疫技术，由于操作过程中对血管组织进行高速匀浆和离心等，导致了糜酶与ACE活性损耗，引起肥大细胞胞浆内游离糜酶大量释放，同时破坏了糜酶的复合体结构，造成检测误差，故而影响检测的准确性。 易损斑块破裂、急性血栓形成造成冠脉急性闭塞是急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome，ACS)的主要发病机制已成为共识。寻求稳定易损斑块的靶点已成为国内外学者研究的重要方向。由于糜酶对AS的多重影响，导致AS斑块纤维帽变薄、降低斑块稳定性而促进斑块向易损性方向发展。糜酶已成为斑块向易损方向发展的关键因素，能否通过阻断糜酶活性进而促进斑块的稳定性，已引起国内外学者的重视。 由于糜酶结构功能存在很大的物种差异性，传统用于AS研究的家兔、大鼠、小鼠和猪等动物不适用于模拟人类糜酶的研究，目前针对叙利亚仓鼠糜酶的基因敲除或沉默治疗尚难以开展。现阶段常用于抑制动物体内糜酶活性的药物包括肥大细胞膜稳定剂曲尼司特和一些特异性非肽类糜酶抑制剂(如BCEAB、SUN-C8257和NK3201)，但后者尚处于研究开发阶段，相关的机制研究尚不明确，目前尚无公认的特异性糜酶抑制剂用于科研和临床。Jin等首先研究证实曲尼司特可以高效地抑制血管组织中糜酶活性，阻断糜酶介导的AngⅡ生成。随后的大量研究证明，曲尼司特用于抑制糜酶活性的剂量应是常规剂量的10倍，曲尼司特可以显著抑制血管移植及PTCA术后血管糜酶活性。曲尼司特是一种过敏递质阻释剂，它可抑制肥大细胞的磷酸二酯酶，稳定细胞膜，防止细胞脱颗粒和释放糜酶等化学递质，同时，还可以抑制肥大细胞增殖，使细胞停滞于G0/G1期，减少其数量，从而起到减少糜酶分泌进而发挥稳定斑块的治疗作用。 纵观国内外的研究成果，尽管目前在糜酶与AS病变的研究方面已取得了一定进展，但在糜酶与AS的相互关系的研究领域中仍存在许多重大问题亟待解决： (1)目前尚缺乏适用于前瞻性研究糜酶活性增高对AS病变影响的动物模型。受糜酶结构功能物种差异性等因素的影响，糜酶与AS的在体研究尚停留停留在回顾性研究阶段，缺乏适用于前瞻性研究糜酶激活对AS病变影响的模型。(2)如何建立检测组织糜酶活性的可靠方法?目前糜酶活性的检测方法尚不统一，常用的糜酶活性HPLC和RIA检测法存在较大的缺陷，亟待建立可靠的检测方法。(3)能否通过在体研究激活或抑制糜酶活性对AS病变的影响，进一步揭示血管糜酶在AS斑块易损过程中的作用机制呢?(4)能否通过曲尼司特抑制血管糜酶活性延缓AS病程的进展，进而增加斑块的稳定性，为糜酶作为治疗靶点提供充分的理论依据? 以上问题构成本课题的设计思路和研究目的。 方法 1.AS斑块糜酶活性的方法学研究 (1)AS模型的建立：120只8周龄雄性金黄叙利亚仓鼠，随机分成正常对照组(A组)15只，AS斑块组(B1组～B7组)每组15只共105只。A组采用普通饲料喂养，B1～B7组采用高脂饲料(0.5﹪胆固醇+10﹪猪油+89.5﹪基础饲料，每只12～15g.d-1)喂养12周。第12周末行血流动力学检测，并在A组随机处死1只仓鼠，检验腹主动脉无AS斑块形成；在B1～B7组每组随机处死1只仓鼠，验证腹主动脉产生动脉粥样硬化病变。 (2)抗原致敏：第13周初进行抗原致敏，取1ml卵白蛋白悬浮液(10﹪卵白蛋白+3﹪氢氧化铝)对B2～B7组仓鼠双侧腋下及腹股沟皮下各注射0.15ml，腹腔注射0.4ml，联合腹腔注射百日咳白喉破伤风三联疫苗2ml(约含1010百日咳菌株)，诱发仓鼠体内发生Ⅰ型超敏反应，产生IgE抗体，与肥大细胞特异性结合，致敏肥大细胞。对A组和B1组仓鼠注射等量生理盐水假致敏，分别作为正常对照和高脂对照。 (3)抗原激发：第15周末，每组抽取半数仓鼠作为激发(假激发)术前的自身对照，然后对B3～B7组剩余的半数仓鼠进行腹主动脉局部封闭注射卵白蛋白，诱导糜酶释放：在髂总动脉以上的约2cm的腹主动脉段两端结扎暂时阻断血流10分钟，于近心端沿动脉血流方向分别注射0.5﹪、1﹪、2.5﹪、5﹪和10﹪的卵白蛋白悬浮液0.2ml(分别含1mg、2mg、5mg、10mg和20mg卵白蛋白)，激活血管组织中致敏的肥大细胞大量释放糜酶。对假致敏的A组、B1组和致敏的B2组仓鼠实施假激发术(注射生理盐水)。术后48小时处死剩余仓鼠。 2.AS斑块糜酶活性的干预性研究 (1)AS模型：60只8周龄雄性金黄叙利亚仓鼠，随机分成正常对照组(A组)15只，AS斑块组(B1组～B3组)每组15只共45只。A组采用普通饲料喂养，B1组～B3组采用高脂饲料喂养12周，每周末监测体重。第12周术在A组随机处死1只仓鼠，检验腹主动脉无AS斑块形成；在B1组～B3组每组随机处死1只仓鼠，验证腹主动脉产生动脉粥样硬化病变。 (2)糜酶活性干预：从第13周开始，对实验仓鼠进行以下干预：对B2组仓鼠注射卵白蛋白悬液及三联疫苗致敏其体内肥大细胞(同方法学研究)，每日给予蒸馏水灌胃，致敏3周后处死半数做激发术前自身对照，对剩余的仓鼠进行腹主动脉局部封闭注射5mg卵白蛋白进行抗原激发(通过方法学研究所确定的剂量)，作为糜酶激活组；对B3组仓鼠注射安慰剂假致敏，每日给予肥大细胞活性抑制剂曲尼司特400mg/kg灌胃，3周后每组处死半数做假激发术前自身对照，对剩余仓鼠注射安慰剂实施假激活术，作为曲尼司特治疗组；对A组和B1组仓鼠注射安慰剂(生理盐水)假致敏，每日给予蒸馏水灌胃，3周后每组处死半数做假激发术前自身对照，对剩余仓鼠注射安慰剂实施假激活术，分别作为正常对照和高脂对照。术后48小时处死各组剩余仓鼠。根据方法学研究所确定的血管体外灌流技术观察血管的糜酶与ACE活性变化。 结论 1.本研究通过对卵白蛋白抗原预致敏的AS仓鼠实施局部血管段抗原攻击的方法，有效地激活了该段AS血管的糜酶活性，成功地建立了适用于前瞻性观察糜酶活性对AS病变影响的动物模型。 2.血管灌流技术克服了以往研究对细胞结构破坏的不足，具有保护组织细胞结构功能完整性的优点，是研究糜酶活性较为理想的方法学。 3.通过在体研究激活或抑制糜酶活性对AS病变的影响，证实了糜酶能够通过加重斑块的炎症反应、加剧斑块脂质沉积、促进斑块纤维帽中胶原的降解和平滑肌细胞的凋亡等多种途径诱导AS病程进展，增加斑块的易损因素。 4.证实曲尼司特治疗有效地降低了AS血管的糜酶活性，通过抑制斑块的炎症反应、减轻斑块脂质沉积、抑制斑块纤维帽中胶原的降解和平滑肌细胞的凋亡而减轻斑块的易损性，为糜酶抑制剂作为抗AS治疗靶点提供了直接的实验证据。

目录

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符号说明

第一部分 动脉粥样硬化斑块中糜酶活性的方法学研究

前 言

1、材料与方法

2、结 果

3、讨 论

4、结 论

附 表

附 图

参考文献

第二部分 动脉粥样硬化斑块中糜酶活性的干预性研究

前 言

1、材料与方法

2、结 果

3、讨 论

4、结 论

附 表

附 图一

附 图二

附 图三

参考文献

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文