苦瓜过氧化物酶对茋类及黄酮类天然产物的生物转化研究

摘要

植物过氧化物酶是一类以血红素为辅基的酶类，在植物界中广泛存在，主要催化H<,2>O<,2>和过氧化物对有机物氧化，有着广泛的生理作用。本论文从苦瓜果实中提取分离过氧化物酶(MCP)并实现其对芪类及黄酮类天然产物的生物转化，分离并鉴定了16个转化产物，其中新化合物5个，首次利用过氧化物酶实现天然产物的生物转化而获得的已知化合物2个．首次利用苦瓜讨氧化物酶实现天然产物的生物转化而获得的已知化合物8个。对其中3个生物转化产物进行了自由基清除活性实验. 1.苦瓜过氧化物酶的提取分离 苦瓜果实经tris-HCl缓冲液抽提、(NH4)<,2>S0<,4>盐析得到过氧化物酶粗蛋白，经非变性不连续聚丙烯酞胺垂直平板电泳，发现其中主要含有三条过氧化物酶同工酶谱带，利用Bradford检测法测定其蛋白含量为0.86 mg/ml，并用愈创木酚比色法测定其酶活为3786.05 U/mgo 2.苦瓜过氧化物酶对芪类及黄酮类天然产物的生物转化研究 芪类化合物是一类在各种诱发因子或植物病原菌的侵染作用下诱导合成的多酚类次生代谢物。其中，白黎芦醇是广泛存在于水果、中药和葡萄酒中的一种菌类植物抗毒素，其低聚物具有广泛的生物学活性，如抗癌、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗HIV、抗炎抗菌、免疫调节及神经保护等。 为进一步利用芪类天然产物资源，探讨了苦瓜过氧化物酶对白黎芦醇的生物转化。利用苦瓜过氧化物酶，在醋酸缓冲液(pH 5.0)/丙酮反应体系中25℃条件下催化氧化白黎芦醇，获得其生物转化产物，经硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱，半制备高效液相等色谱技术分离得到6个化合物，分别为resveratrol trans-dehydrodimer (Ⅰ),parthenostilbenins A and B (Ⅱ, Ⅲ)，restrytisol B (IV)，leachianol G (Ⅴ)，7-o-acetylatedleachianol G(VI)。其中，化合物VI为新化合物，化合物Ⅱ，Ⅲ为首次利用过氧化物酶实现白藜芦醇的生物转化而得到的已知化合物，化合物Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ为首次利用MCP实现白藜芦醇的生物转化而得到的已知化合物。此外，本文运用HPLC法深入探讨了苦瓜粗蛋白在不同生物转化条件下催化白藜芦醇转化反应的规律。发现25℃下，在醋酸缓冲液(pH 5.0)/丙酮反应体系中，H<,2>O<,2>浓度为0.11 mol/L，时，白藜芦醇的转化率最高，反应在滴加H<,2>O<,2>后10 min内完成，反应时间的延长并不有利于反应进行。利用苦瓜粗蛋白在醋酸缓冲液(pH 5.0)/丙酮反应体系中30℃条件下催化氧化白藜芦醇及阿魏酸的1/1混合物(摩尔比)，获得其生物转化产物，运用LC-MS法对转化产物进行分析，除发现白藜芦醇与阿魏酸各自的转化产物外，还得到了白藜芦醇与阿魏酸的二聚体，经硅胶柱层析，半制备高效液相等色谱分离技术及重结晶技术纯化得到2个化合物，一个是阿魏酸的脱氢二聚体(Ⅶ)，另一个是白藜芦醇和阿魏酸的二聚体(Ⅷ)，化合物Ⅷ为新化合物。 天然黄酮类化合物是植物体多酚类的中间体或代谢物，广泛存在于药用植物、水果和蔬菜中。现代药理研究表明，该类化合物在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面有明显的药理作用，其抗氧化性质及其在植物氧化酶作用下的代谢，亦引起学者们的广泛关注。 本文利用苦瓜粗蛋白在醋酸缓冲液中(pH 5.0)/乙醇反应体系25℃条件下催化氧化槲皮素，获得其生物转化产物，经硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱，半制备高效液相等色谱技术分离得到6个化合物，IX，X，Xl，XII，XllI，XIV，其中XII，XIII为新化合物，IX，x，XI，XIV是首次利用MCP实现槲皮素的生物转化而得到的已知化合物。 利用苦瓜粗蛋白在醋酸缓冲液中(pH 5.0)/二氧六环反应体系25℃条件下催化氧化葛根素，获得其生物转化产物，经硅胶柱层析，Sephadex LH．20柱，半制备高效液相等色谱技术分离得到2个化合物，其中一个为葛根素的乙酰化产物XV，一个为脱水产物XVI，化合物XVI为新化合物，XV是首次利用MCP实现葛根素的生物转化而得到的已知化合物。 3．生物转化产物的药理活性研究 对化合物I、VlI、VIII进行了自由基清除以及心肌细胞损伤保护活性实验。结果显示，化合物l、VII、VllI有较强的自由基清除活性，其对心肌细胞的预处理可保护2其不受阿霉素引起的氧化损伤。其中化合物Ⅶ、Ⅷ表现出较各自底物更强的抗氧化活性，而化合物Ⅰ的活性较其底物弱。初步分析其构效关系，分子中酚羟基的数目、位置对化合物的自由基清除活性有重要作用。

目录

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摘要

符号说明

第一章植物过氧化物酶对芪类及黄酮类天然产物的生物转化

1过氧化物酶的催化机制

2芪类化合物的生物转化

3黄酮类化合物的生物转化

3.1黄酮类化合物的低聚反应

3.2黄酮类化合物的多聚反应

第二章苦瓜过氧化物酶的提取分离

第一节材料与方法

1.材料与仪器

2.苦瓜过氧化物酶的提取分离

3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定苦瓜过氧化物酶同功酶

4.蛋白质含量测定

5.苦瓜过氧化物酶的活性测定

第二节结果与讨论

第三章苦瓜过氧化物酶对芪类及黄酮类天然产物的生物转化

第一节苦瓜过氧化物酶对白藜芦醇的生物转化研究

1.化合物的结构鉴定

2.不同生物转化条件对白藜芦醇氧化反应的影响

3.实验部分

第二节苦瓜过氧化物酶对白藜芦醇与阿魏酸混合物的生物转化研究

1.转化产物的HPLC-MS研究

2.化合物的结构鉴定

3.讨论

4.实验部分

第三节苦瓜过氧化物酶对槲皮素的生物转化研究

1.化合物的结构鉴定

2.实验部分

第四节苦瓜过氧化物酶对葛根素的生物转化研究

1.化合物的结构鉴定

2.实验部分

第四章药理活性研究

第一节自由基清除活性

1.材料与方法

第二节对阿霉素引起的心肌细胞损伤的保护作用

1.材料与仪器

2.方法

3.结果与讨论

附录 化合物图谱

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文