剪切力介导血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶9及其信号转导通路的研究

摘要

研究目的: 1、明确不同的剪切力对血管内皮细胞表达MMP-9的影响。 2、通过应用膜整合素的功能阻断抗体明确剪切力是否是通过膜整合素影响内皮细胞表达MMP-9。 结果 1、不同作用时间下，低剪切力对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响将HUVCECs暴露于低剪切力1小时，MMP-9 mRNA的水平与静态时没有明显变化，但当分别作用3、6、8小时时，mRNA水平呈时间依赖性增加。将细胞培养上清液用透析袋浓缩30倍，以胶原酶谱法检测MMP-9的蛋白质活性发现，低剪切力作用于HUVECs3小时，蛋白质活性无明显变化，6小时后，活性水平比静态时升高3.3倍，但比作用8小时后要低。 2、在相同的作用时间下(6小时)，不同的剪切力对HUVECs表达MMP-9mRNA及蛋白质活性的影响探针实时定量RT-PCR显示，震荡剪切力作用6小时后，MMP-9 mRNA的水平比静态对照组增加了6倍，比低剪切力组增加了1.6倍，然而生理性剪切力作用6小时后，其水平比静态对照组降低了3倍，比低剪切力组降低了10倍。 3、不同剪切力作用下，膜整合素对HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质活性的影响将膜整合素β1、β 3、α v β 3功能阻滞抗体分别与HUVECs共培养2小时，然后分别予以低剪切力或震荡剪切力6小时，探针实时定量RT-PCR结果显示，与无抗体干预组相比，这三种抗体均能明显抑制HUVECs对MMP-9 mRNA的表达，胶原酶谱法亦显示MMP-9的蛋白质活性被这三种抗体明显抑制。 4．我们的研究结果表明，膜整合素参与了剪切力诱导HUVECs表达MMP-9的力学信号转导通路。 结论 1.低剪切力及震荡剪切力均能诱导体外培养的HUVECs对MMP-9mRNA的表达，且增加MMP-9蛋白质活性，而生理性剪切力却能抑制HUVECs对MMP-9 mRNA的表达及其蛋白质活性，明确了力学与血管内皮细胞表达MMP-9的关系。 2.不同的剪切力通过膜整合素诱导HUVECs表达MMP-9 mRNA及蛋白质，膜整合素亚型β1、β 3、α v β 3在该过程中起主要作用，进一步阐明了力学影响内皮细胞表达MMP-9的可能机制。 血管内皮细胞(Endothelial cell，EC)衬于血管的内壁，直接承受着血液流动产生的剪切力。血流动力学因素异常出现层流剪切应力不均匀，内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少，这时高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用即可促使动脉粥样硬化病变发生。动脉分叉处和转弯处可出现紊乱的血流方式，如低幅波动的壁剪切应力、分流和逆流。动脉的这些部位是最易受损的区域，也正是动脉粥样硬化典型病变的易发位点。显然，动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定，而与危险因素或其他相关因素本身无关。该定位分布特点在人体和实验动物上均已得到证实，这有力地说明剪切应力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。 基质金属蛋白酶9(MMP-9)是明胶酶的一种，又称明胶酶B，在体内可被多种细胞，如内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等分泌。它为降解细胞外基质(ECM)所需，能降解血管内膜细胞外基质，导致白细胞渗透进入血管壁，平滑肌细胞迁移至发展中的新生内膜。而这两个过程是动脉粥样硬化发生发展所必需的。MMP-9的表达及活性增强与AS的发生、发展密切相关。我们的研究已证明，在体外培养的HUVECs中，低剪切力和震荡剪切力能够刺激MMP-9 mRNA的表达及增加其蛋白质活性，而生理性剪切力能够抑制此种表达。但对其信号转导通路未完全清楚。整合素是一组跨膜糖蛋白，是连接细胞外基质与细胞内骨架蛋白的桥梁，能在细胞膜上进行双向的信息传递：来自细胞内的信号可调控整合素与细胞外配体的结合活性(inside-out signaling)，同时，细胞外的信号可通过整合素传递至细胞内，引发细胞的生物学功能的改变(outside-insignaling)。研究证明，整合素是一种机械感受器，依赖整合素的信号传导途径参与了血管内皮细胞对剪切应力的反应。整合素可激活胞质内多种蛋白质激酶(如MAPKs)，引发细胞内的信号传递过程。我们的研究已证实，膜整合素参与了剪切力诱导的MMP-9表达的调节，但其下游分子尚不明了。 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统，在炎症的发生、发展和细胞因子的生成中起重要的作用。目前哺乳动物细胞中已发现4种MAPK信号分子，即ERK1/2、JNK、p38和ERK5亚家族。已有研究表明，MAPK参与了力学信号在细胞内的信号转导过程，但其与剪切力诱导的MMP-9表达的关系尚不清楚。 目前在血管内皮细胞上已发现至少有四种转录因子可被剪切力激活，其中包括核转录因子K B(NF-K B)。研究证明：剪切应力刺激诱导血管内皮细胞I K B的磷酸化和降解；可促使其亚单位p50、p65向核内转移，与特异的DNA序列结合，调节目的基因的表达。 上述情况说明，剪切力能分别激活整合素、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子K B(NF-K B)以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)，然而，剪切力在诱导内皮细胞分泌表达MMP-9过程中与整合素、MAPK s及NF-K B之间的信号转导关系尚未见报道。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

中文摘要Ⅰ

英文摘要Ⅰ

符号说明

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5创新点和限制性

6结论

附图

参考文献

论文II低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 中文摘要Ⅱ

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 英文摘要Ⅱ

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 1前言

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 2材料和方法

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 3结果

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 4讨论

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NFκB途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 5创新点和限制性

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 6结论

论文Ⅱ低剪切力在内皮细胞通过膜整合素/MAPKs/NF κ B途径调节基质金属蛋白酶9表达的研究 附图

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致谢

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