SHP2在幼鼠细菌性脑膜炎中的表达及原钒酸钠对脑膜炎脑损害的影响

摘要

研究背景与目的：细菌性脑膜炎，也称化脓性脑膜炎，是一种严重危害儿童和成人健康的感染性疾病。它是由各种化脓菌引起的以脑膜炎症为主的中枢神经系统感染性疾病。发病率与年龄有关，婴幼儿多见，2岁以内发病者约占本病的75％，发病高峰年龄6～12个月。随着抗生素和糖皮质激素的广泛使用，本病的发病率已明显减少，但仍有较高的死亡率和致残率。近30％的病人威胁生命，并有高达50％的存活者留有不同程度的神经系统后遗症。因此研究细菌性脑膜炎的病理生理机制，研究在细菌性脑膜炎病理生理过程中起脑保护作用的因素和加重脑损害作用的因素及其机制，可以有助于提高脑保护因素而降低脑损害因素，从而改善细菌性脑膜炎的预后。动物模型的建立为人们研究细菌脑膜炎的病理生理机制提供了便利条件。 近年来的研究显示，炎性刺激因子如革兰氏阴性菌的脂多糖和革兰氏阳性菌的肽聚糖可以激活I-kB激酶NF-kB通路和3丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，而后一系列转录因子被激活，如NF-kB(p50/p65)、cFos/cJun，它们又协调多种炎症介质基因的表达。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)分别对蛋白酪氨酸残基起着磷酸化和脱磷酸的作用。已知蛋白酪氨酸残基的磷酸化控制着体内很多重要的生理过程，包括细胞的增殖和分化。SHP1、SHP2是哺乳动物两种重要的胞浆PTPases，它们均有氨基端两个SH2区和羧基端一个磷酸酶区。SH2区决定反应的特异性。虽然两者结构有极大的相似性，但作用却是相反的。SHP1在信号转导中主要起负调控作用，起抑制细胞增殖和分化的作用，而SHP2在细胞信号转导中主要起正调控作用即促进信号转导，起促进细胞增殖和分化的作用。SHP2还参与Ras-Raf-MAPK信号通路的激活。SHP1的负向调节和SHP2的正向调节作用间可能既存在拮抗，又保持动态平衡，此平衡的改变将影响细胞的增殖分化及信号转导。如在实验性脑缺血损伤中，SHP1和SHP2在反应性激活的星形胶质细胞中表达均升高。SHP2被认为控制着胶质细胞从成熟静止型向激活型的转变，SHP1则被认为限制着损伤诱导的胶质细胞的过度增殖。因为细菌性脑膜炎时的炎性刺激因子和SHP2激活相同的信号转导通路，所以SHP2有可能参与细菌性脑膜炎的炎症反应。因为在肺炎链球菌脑膜炎的基因图谱中，已证实SHP1的表达在炎症的急性期是升高的，所以我们认为SHP2在细菌性脑膜炎中的表达也应该是升高的。为证实这一假设，本文建立了幼龄大鼠细菌性脑膜炎的模型，研究了SHP2在鼠脑基因转录和蛋白水平的表达及与脑脊液白细胞计数、TNF-alpha浓度的关系，并用酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠(SOV)抑制SHP2及酪氨酸磷酸酶的活性，以观察其对细菌性脑膜炎脑损害程度的影响，以探讨SHP2及酪氨酸磷酸酶在细菌性脑膜炎中的作用。 材料与方法： ①研究对象：3周龄清洁级Wistar大鼠共101只。58只大鼠被随机分为脑膜炎组(n=48)和对照组(n=10)，脑膜炎组再根据不同的处死时间分为4个小组，分别为接种后1天、3天、7天和14天组。43只脑膜炎大鼠被分为原钒酸钠(SOV)干预组(n=20)和生理盐水组(n=23)，其中SOV组和生理盐水组各8只于脑膜炎恢复后进行水迷宫测试，其余27只行病理学观察。 ②幼鼠细菌性脑膜炎的诱导：参照刘心洁和Leib的方法，小脑延髓池穿刺，移去50 ul脑脊液，然后注入50ul浓度为3-9×10<'5>cfu/ml的肺炎链球菌悬液，对照组注入50ul灭菌生理盐水。感染后1 8h，取脑脊液少量于绵羊血琼脂糖培养基上培养24小时以证实脑膜炎的形成。 ③组织处理：动物处死前抽取脑脊液50-100ul以检测脑脊液TNF-alpha浓度和进行白细胞计数。左心灌注PBS后，做RT-PCR和Western blot检测的鼠脑分离大脑皮层和海马，迅速放入-80℃冰箱中备用。做免疫组化和病理学观察的鼠脑用4％多聚甲醛灌注后，再用4％多聚甲醛固定1-3天，后换至30％蔗糖溶液中直至组织块下沉。做冠状面冷冻切片，贴于防脱玻片上，晾干后存于-20℃冰箱中备用。 ④检测方法：SHP2基因转录水平的检测采用RT-PCR的方法，依次经过2总RNA提取、cDNA的合成和PCR反应等步骤。SHP2mRNA的定量采用与看家基因beta-actin的mRNA水平进行比较的方法进行测量。SHP2蛋白水平的检测采用Western blot的方法，依次经过总蛋白提取、SDS-PAGE电泳、电转膜、抗原抗体反应和显色等步骤。SHP2蛋白的定量采用与beta-actin的蛋白水平相比较的方法进行测量。SHP2在鼠脑的免疫组化染色采用三步法(SP法)，依次经过抗原修复、清除内源性过氧化物酶、山羊血清封闭、滴加一抗、滴加二抗、DAB显色、复染及脱水透明、封片。脑脊液TNF-alpha含量测定采用放免法，操作严格按说明书进行。 ⑤27只脑膜炎大鼠被随机分为原钒酸钠组(n=12)和对照组(n=15)。SOV组在脑池内注入细菌同时按2ml/kg腹腔注射浓度为27mmol/l PH值为7.4的原钒酸钠溶液，每日1次，共注射7天。对照组腹腔注射同等剂量的灭菌生理盐水(2ml/kg)并持续相同时间。观察两组大鼠临床结果、外周血和脑脊液白细胞计数、肿瘤坏死因子浓度和脑组织损伤评分的差异。 ⑥原钒酸钠组和生理盐水组各8只大鼠于细菌接种后第21天开始进行水迷宫测试以观察对空间学习记忆能力的影响，为期4天。计算每天各组大鼠到达平台的平均时间。 ⑦所得计量资料以均数±标准差表示，t检验作两组均数间比较，单因素方差分析基础上q检验作多组均数间两两比较，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis检验或Wilcoxon检验。两变量的相关性采用Pearson相关系数。率的比较采用Fisher's检验。P<0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.脑膜炎组大鼠脑脊液均培养出与接种同株的肺炎链球菌(脑膜炎组大鼠脑脊液培养的细菌与接种的肺炎链球菌同株)且有较高的细菌滴度，对照组大鼠脑脊液无细菌生长。 2.脑膜炎大鼠轻者仅表现为精神稍差、吃食少，重者表现为精神差、嗜睡、反应迟钝，有的表现为转圈、翻跟头等。脑膜炎组脑组织可见蛛网膜下腔、脑室和软脑膜中性粒细胞、纤维蛋白渗出。皮质损害表现为白细胞聚集和神经元坏死，且皮层损害主要见于鼠脑的基底面即腹侧面，背侧面未见明显皮质损害。正常对照组未见病理损害。 3.脑膜炎模型组皮层SHP2mRNA表达水平于脑膜炎第3天达到高峰，达0.200±0.049，约为正常对照的5倍。脑膜炎第7天，皮层SHP2mRNA水平有轻度下降，为0.1 29±0.032，但与对照组相比仍有显著差异(P<0.05)。第14天，皮层SHP2mRNA水平已降至正常。 4.脑膜炎模型组皮层SHP2蛋白表达于脑膜炎第3天，开始明显升高，达0.678±0.041。与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。脑膜炎第7天，皮层SHP2蛋白水平达到高峰，为1.181±0.042，接近正常对照的9倍。第14天，皮层SHP2蛋白表达仍维持在较高水平，为0.556±0.071，与对照组相比仍有显著性差异(P<0.01)。 5.免疫组化染色显示，SHP2免疫反应阳性细胞广泛分布于正常大鼠和脑膜炎大鼠的皮层，神经元和胶质细胞均见阳性表达。与正常对照相比，脑膜炎大鼠第三脑室周围SHP2阳性染色细胞明显增多，从形态上看多为胶质细胞。 6.与正常对照组相比，脑膜炎大鼠脑脊液TNF-alpha浓度明显升高(分别为1.55±0.1 ng/ml、2.47±0.68 ng/ml，P<0.005)，白细胞计数明显增加(分别为120±40/u l、1586±1152/ul，P<0.005)。SHP2的蛋白表达量与脑脊液白细胞计数呈显著正相关(r=0.77，P<0.001)，而与脑脊液TNF-alpha浓度无明显相关性。 7.应用酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠(SOV)明显提高了脑膜炎大鼠脑脊液中TNF-alpha的浓度[SOV组(n=12)为4.51±1.22ng/ml，生理盐水组(n=15)为1.99±0.31ng/ml，P<0.001]，增加了脑组织损伤评分[SOV组中位数为42(36-48)，生理盐水组为18(12-24)，P<0.02]，而对外周血和脑脊液白细胞计数无明显影响。脑膜炎恢复后，SOV干预组大鼠平均到达平台时间较生理盐水组明显延长[分别为(23.8±3.6)s、(19.5±4.2)s，P<0.05]。 结论： 1.脑池内注入3-9×10<'5>cfu/ml的肺炎链球菌悬液可以成功地建立肺炎链球菌脑膜炎模型。 2.在细菌性脑膜炎中，蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的表达无论在基因转录水平还是蛋白水平均明显升高。 3.蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的蛋白表达量与脑脊液白细胞计数呈显著正相关，而与脑脊液TNF-alpha浓度无明显相关性，说明SHP2在细菌性脑膜炎的发病机制中并不发挥重要的作用，但可作为病情变化的观察指标。 4.蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠抑制SHP2及总蛋白酪氨酸磷酸酶的活性后，提高了脑膜炎大鼠脑脊液中TNF-alpha，的浓度，加重了脑膜炎大鼠的脑组织病理损害和大鼠空间学习记忆能力的损害，证明了蛋白酪氨酸磷酸酶，特别是SHP2在细菌性脑膜炎中有一定的脑保护作用。

目录

论文说明：符号说明

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第一部分 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在幼鼠细菌性脑膜炎模型中的表达及与脑脊液白细胞计数和肿瘤坏因子浓度的相关性

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠对幼鼠细菌性脑膜炎脑损害的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 细菌性脑膜炎预后因素分析

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