PCR-ACRS法筛查成年汉族人CYP21基因P459H的突变位点

摘要

目的： 先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一种较常见的常染色体隐性遗传病，由21-羟化酶缺陷引起者约占90％～95％。此酶由21-羟化酶基因编码，缺乏可引起皮质醇合成不足以及前体底物堆积。主要临床表现是性发育畸形：女性患者外生殖器男性化，男性患者出现假性性早熟。21-羟化酶基因位于人类6号染色体短臂6p21.3组织相容性抗原Ⅲ(HLAⅢ)基因区，由无活性的假基因(CYP21P)和有活性的真基因(CYP21)串联排列组成。大约95％的CYP21基因突变是由于真假基因相互作用引起，其余5％的患者等位基因含有特别的突变。迄今已发现80余种CYP21基因突变导致21-羟化酶缺陷症(21-OHD)，目前国内仅是对较常见的9个突变进行检测，尚未见新的基因突变报道。我们在前期工作中收集了3个21-OHD家系，采用PCR扩增产物直接测序的方法，对患者及其家系进行基因突变分析，发现了一个国内外尚未见报道的新突变P459H(即外显子10第459位密码子CCC突变为CAC，导致编码蛋白质上相应的脯氨酸变为组氨酸)。为进一步验证该基因突变确实属于点突变，而非基因多态，本研究采用PCR结合扩增引进限制性内切酶酶切位点(PCR-ACRS)的方法对100名正常成年汉族人该位点进行分析。 方法： 1例CAH患者，社会性别为女性，通过临床表现，皮质醇、促肾上腺皮质激素(ACTH)、17-羟孕酮(17-OHD)、睾酮(T)等激素测定和影像学检查确立诊断。100例正常成年汉族人从山东大学齐鲁医院健康查体中心随机选取，平均年龄(28±5)岁，其中男性52例，女性48例。相互之间无亲缘关系，排除CAH家族史。 取受检者外周静脉血2ml，EDTA-K2抗凝。抽提基因组DNA，根据真假基因序列的差别，设计特异性引物扩增CYP21基因3～10外显子，Pst Ⅰ限制性内切酶消化验证PCR产物为特异性扩增。应用PCR-ACRS方法扩增所有样本的首次PCR产物，Fsp Ⅰ限制性内切酶酶切后用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)筛查P459H变异的发生率。 结果： 1．首次PCR扩增产物即CYP21基因第3～10外显子用Pst Ⅰ限制性内切酶酶切，由于真假基因上Pst Ⅰ限制性内切酶酶切位点数目不同，造成酶切片段大小不同，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，可以鉴别真假基因，经Pst Ⅰ限制性内切酶证实所扩增的均为真基因序列。 2．患者CYP21基因第10外显子携带P459H变异(CCC→CAC)，100例正常成年汉族人CYP21基因第10外显子密码子459均为CCC，即均未出现P459H变异。 结论： 1．PCR扩增的CYP21基因第3～10外显子序列，经Pst Ⅰ限制性内切酶酶切可以有效鉴别真假基因。 2．100例正常成年汉族人均没有携带P459H变异，从而排除了该位点基因多态的可能。P459H点突变首次在中国人21-OHD患者中发现，国外并未有关这一突变的报道，推测可能为一罕见突变。 3．PCR-ACRS是一种快速、可靠的检测基因点突变的有效途径。

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前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附图

参考文献

综述：21-羟化酶缺陷症基因诊断方法的研究进展

致 谢

攻读硕士学位期间发表论文