血管生成在肝细胞肝癌发生及发展中的作用研究

摘要

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中居第三位。HCC的发病率在亚洲和非洲最高，在美国和西欧等发达国家也呈逐年上升趋势。HCC血供非常丰富，血管生成对肿瘤的生长、侵袭和转移都有决定性的作用，而且在发病早期就有血管侵犯和肝内转移的倾向，故预后较差。HCC的发生是一个在复杂的遗传背景下由多个因素参与的过程，对HCC发生发展的分子机制进行深入细致的研究极为重要。在肿瘤血管生成过程中，内皮细胞的基因改变和生物学行为的变化开始引起人们的重视。 本研究拟应用人类全基因组芯片技术，比较HCC组织相对正常肝组织基因表达谱的改变，寻找在HCC发生发展中的差异表达基因，为HCC的研究和临床治疗提供新的靶点。在差异表达的基因谱中挑选有重要意义的基因，进行体内外实验研究以探索这些差异表达基因在HCC中的作用：一方面我们对HCC患者肿瘤组织进行研究，验证差异表达基因的表达水平；另一方面对HCC血管内皮细胞进行分离、纯化和鉴定，探讨血管内皮细胞在HCC血管生成和发生发展中的作用。 方法： 1.收集2例HCC患者的癌组织和2例正常对照肝组织，经HE染色确定相应组织的病理类型后，用Trizol一步法抽提组织的总RNA，对提取和纯化的RNA进行1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳做质量检测，并进行反转录、荧光标记和纯化。然后将肝癌组织与正常对照肝组织的RNA进行杂交、洗涤，用LuxScan 10KA扫描仪获取图像。根据芯片杂交的最终数据，按照荧光密度比值≥2.0或者≤0.5筛选出差异表达基因。 2.收集42例HCC患者的癌组织和癌旁组织，其中男性34例，女性8例，平均年龄59.4岁(32～74岁)，组织标本均经过病理学诊断证实。用免疫组化染色检测CD31标记的微血管密度，用荧光实时定量PCR法、Western blot和免疫组化方法检测差异表达基因在HCC和对照肝组织中mRNA和蛋白水平的表达及组织学定位。 3.收集病理学证实的新鲜肝癌组织和癌旁组织，用CD31单克隆抗体标记的免疫磁珠分离、纯化组织中的血管内皮细胞，并对获得的内皮细胞进行培养和鉴定，用荧光实时定量PCR和Western blot检测差异表达基因在内皮细胞中mRNA和蛋白水平的表达。 结果： 1.HE染色结果显示HCC癌组织及正常对照肝组织呈典型的组织病理学改变；1％琼脂糖凝胶电泳结果显示抽提的组织总RNA的质量高，无降解现象。芯片扫描结果发现2张芯片中共同差异表达基因855个，其中上调的基因为457个，下调的基因为398个。Cluster聚类分析表明HCC的发生发展过程相当复杂，其中涉及癌基因与抑癌基因、编码细胞周期相关蛋白的基因、与细胞应激相关的基因、细胞骨架和运动相关的基因、细胞凋亡相关的基因、调节DNA合成、修复和重排相关的基因、细胞因子受体相关基因、免疫蛋白相关基因、细胞代谢相关基因、信号转导相关基因、调节转录的基因、与生长发育相关的基因等多个通路的多条基因，尚有部分基因不能分类。 2.PRL-3在HCC组织中表达明显升高，同癌旁组织相比差异有显著统计学意义。免疫组化染色显示，PRL-3主要定位于细胞浆。与患者临床资料进行相关分析显示，HCC组织中PRL-3的mRNA水平与血清AFP水平、肿瘤血管侵袭和肿瘤转移状况呈正相关。PRL-3与CD31染色标记的微血管密度(MVD)呈正相关(r=0.583，P＜0.001)通过检测MMP-2、MMP-9和E-cadherin在HCC组织中mRNA和蛋白水平的表达发现，PRL-3与MMP-2(r=0.695，P＜0.001)、MMP-9(r=0.554，P＜0.001)表达呈正相关，和E-cadherin(r=0.731，P＜0.001)表达呈负相关。 3.用免疫磁珠分选获得血管内皮细胞的纯度在90％以上。从HCC组织中分离的血管内皮细胞呈现典型的内皮细胞的形态特征，免疫细胞化学和荧光染色证实此内皮细胞高表达vWF，在半定量RT-PCR检测中该细胞表达CD31，CD146，而不表达AFP及CD45。在HCCIfit管内皮细胞中PRL-3、MMP-2、MMP-9在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显升高。 结论： 1.本研究利用人类全基因组芯片技术对HCC肿瘤组织与正常对照肝组织进行了差异表达基因的筛选和综合分析，发现了在HCC发生发展中的多个差异表达基因，其中许多基因对HCC的分子机制研究有较大的价值。 2.在组织学水平的检测中，PRL-3与MMP-2、MMP-9显著高表达，E-cadherin表达显著降低，并且PRL-3与MVD、MMP-2、MMP-9及E-cadherin等肿瘤血管生成和侵袭相关基因的表达密切相关，说明PRL-3是HCC侵袭和血管生成过程中一个非常重要的基因。 3.采用免疫磁分选法有效地分离纯化了HCC组织和癌旁肝组织中的血管内皮细胞，分离的内皮细胞可用于HCC血管生成的相关研究。PRL-3和MMP-2、MMP-9在HCC血管内皮细胞中高表达，提示其在HCC的血管生成和侵袭中可能起重要作用，有望成为新的抗肿瘤血管生成研究和治疗的靶点。 论文二 CD4+CD25+调节性T细胞在真性红细胞增多症中的研究目的： 本研究探讨真性红细胞增多症(Polycythemia vera，PV)患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)的变化以及在本病中可能的作用机制。 方法： 收集21例PV患者和25例正常对照的外周抗凝血，应用流式细胞仪分析外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例。利用磁性细胞分选(magnetic cell sorting，MACS)技术分离CD4+CD25+Treg细胞。用实时定量PCR和Western blot检测CD4+CD25+Treg细胞中PFOXP3在mRNA和蛋白水平的表达。将从PV患者中分离的CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25-T细胞共同培养，检测其免疫抑制功能的变化。 结果： 利用MACS免疫磁珠法分离的细胞纯度较高，均在90％以上。流式细胞学分析结果显示，PV患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞比例为10.93±4.02％，高于正常对照组5.86±1.99％(P＜0.05)；且CD4＋CD25＋Treg细胞中FOXP3在mRNA和蛋白水平的表达量高于正常对照组(P＜0.05)。体外免疫抑制功能试验表明，PV患者CD4+CD25+Treg细胞对激活的CD4+CD25-细胞的抑制作用明显增强。 结论： PV患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞在CD4+T细胞中比例增高且抑制活性增强；CD4+CD25+Treg细胞可能导致了PV中T细胞免疫的异常，从而在该病的发病机制中起一定的作用。

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论文说明:符号说明

声明

论文一血管生成在肝细胞肝癌发生及发展中的作用研究

前言

第一章肝细胞肝癌的基因差异表达研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二章血管生成在肝细胞肝癌组织水平的作用研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三章血管内皮细胞在肝细胞肝癌血管生成中的作用研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文二CD4+CD25+调节性T细胞在真性红细胞增多症中的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

总结与展望

致谢

攻读博士学位期间发表学术论文

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