betA基因的异源表达提高了棉花耐盐和耐低温能力

摘要

甘氨酸甜菜碱(GB)是一种重要的渗透保护物质，在低温、高盐和干旱等逆境胁迫下，许多植物积累甘氨酸甜菜碱作为渗透保护物质以维持细胞正常的渗透压，稳定酶和蛋白复合物的结构和功能，保持膜的完整性。来自大肠杆菌的betA基因编码的胆碱脱氢酶(CDH)兼具有胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能，转移单一的betA基因即可赋予植物积累甘氨酸甜菜碱的能力。 生产中低温和盐渍是限制棉花产量和质量的重要因素之一。提高棉花的耐盐、耐低温能力，对于提高棉花产量，拓宽植棉区域具有重要意义。工作以本实验室得到的转betA基因鲁棉研19的T3代棉花为材料，以鲁棉研19为野生型对照，通过对转基因植株后代的耐盐和耐低温特性进行了分析，结果表明转基因棉花的耐盐和耐低温能力都有明显提高。 betA基因的表达提高了转基因棉花叶片中GB的累积量betA基因的过表达显著提高了转基棉花叶片中GB的含量。利用核磁共振法测定了转基因株系LM1、LM2、LM3、LM4及野生型对照鲁棉研19植株叶片中GB的含量。在正常生长状态下，鲁棉研19植株叶片中GB含量约为99.29μmolg-1DW，转基因株系GB的含量在125.98-214.341μmolg-1DW之间。250mMNaCl处理10天后，棉花植株叶片的GB含量大幅提高，株系LM1、LM2、LM3和LM4植株叶片甜菜碱含量分别为321.06、357.32、355.51和276.09μmolg-1DW，显著高于对照株系176.00μmolg-1DW的GB含量。5℃低温处理24h后，株系LM1、LM2、LM3和LM4植株的GB含量分别为170.78、205.93、248.21和189.46μmolg-1DW，分别是野生型对照109.37μmolg-1DW GB含量的1.56、1.88、2.27和1.73倍，转基因棉花植株叶片的GB含量显著高于野生型对照植株。转基因株系中甜菜碱含量的升高可能是由于高盐、低温胁迫后betA基因的表达水平增强引起的。 转betA基因棉花的耐盐性分析在250mM NaCl浇灌条件下，转基因株系LM1、LM2、LM3、LM4第9天的种子萌发率分别为52.04％、66.04％、60.44％和42.40％，均显著高于野生型28.28％的萌发率。株系LM2、LM3生物量也显著高于野生型对照。250mM NaCl浇灌21天后，野生型对照植株叶片的相对含水量由80.79％降至48.54％，株系LM1、LM2、LM3、LM4叶片的相对含水量分别为62.90％、64.93％、64.44％和63.53％，转基因植株叶片失水速度比对照缓慢。转基因棉花叶片中渗透保护物质可溶性糖、游离氨基酸含量均高于野生型对照，株系LM1、LM2、LM3、LM4的细胞溶质势较野生型对照分别低8.86％、13.89％、3.50％和8.61％，即转基因棉花细胞中积累了更多的溶质，增强了细胞吸取水分和持水能力，从而有利于植株保持正常形态和细胞膨压。株系LM2、LM3细胞膜离子渗漏率分别比野生型对照植株低23.08％和23.56％，叶片丙二醛含量也比野生型对照植株低38.72％和36.03％，说明转基因植株在盐胁迫条件下细胞膜损伤和膜脂过氧化程度都较轻。转基因株系LM2、LM3的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率都明显高于野生型对照，转基因棉花的光合作用系统受到渗透胁迫的影响较野生型对照为轻。在含盐量为0.45％的盐碱地中，转基因株系LM2、LM3的单株籽棉产量远远高于野生型对照，这为培育耐盐棉花新品种提供了优良材料，对于棉花育种具有重要意义。 　　　　转betA基因棉花的耐低温性分析　　在15℃条件下，转基因株系LM1、LM2、LM3、LM4第13天的种子萌发率分别为67.33％、78.20％、70.11％和74.25％，均显著高于野生型53.24％的萌发率。5℃低温处理24h，野生型对照植株叶片的相对含水量由87.94％降至53.43％，转基因株系LM3的叶片相对含水量为66.28％，显著高于对照株系，转基因植株叶片持水能力比对照强。转基因株系LM1、LM2、LM3、LM4的离子渗漏率分别比对野生型对照低22.59％、37.95％、40.28％、23.11％，其中株系LM2、LM3的细胞膜离子渗漏率显著低于野生型对照植株，叶片丙二醛含量也比野生型对照植株低32.96％和39.65％，说明低温条件对转基因株系棉花叶片细胞膜的损害相对较轻，耐低温能力较强。株系LM2、LM3的细胞保护酶SOD的活性比野生型对照分别高4.41％和6.35％，说明转基因植株在低温胁迫条件下，体内保护酶活性处于较高水平，具有较强清除体内自由基的能力。低温胁迫后转基因株系的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率都明显高于野生型对照，转基因株系LM2、LM3的净光合速率分别比野生型对照植株高13.81％和31.61％，转基因植株与野生型对照相比，其光合系统受低温的伤害较轻。 因此，本研究表明来自大肠杆菌的betA基因在棉花中的异源表达可以提高转基因棉花植株中甘氨酸甜菜碱的含量，转基因棉花LM2、LM3的抗逆性有不同程度的提高，为棉花抗逆育种提供了新材料。

目录

论文说明：符号说明

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英文文摘

第一章前言

1.1转基因棉花的研究现状

1.2植物耐盐、耐低温的分子机制

1.2.1低温、高盐等逆境胁迫对棉花的影响

1.2.2植物应对逆境的机制

1.3甜菜碱相关植物基因工程研究现状

1.3.1甜菜碱的生物合成途径

1.3.2甜菜碱的生理功能

1.3.3对转基因植株的保护作用

1.3.4 betA基因工程的研究现状

1.4本工作的目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.2转基因棉花T3代植株的分子检测

2.2.1 CTAB法微量提取棉花叶片DNA

2.2.2 PCR检测

2.3转基因株系的耐盐性分析

2.3.1不同盐浓度下棉花种子的萌发率

2.3.2转基因植株苗期的耐盐性

2.3.3转基因植株苗期叶片甜菜碱含量测定

2.3.4转基因棉花苗期叶片生理生化指标的测定

2.3.5棉花田间产量和农艺性状

2.4转基因棉花的耐低温特性

2.4.1低温处理对种子萌发的影响

2.4.2苗期低温胁迫处理

2.4.3甜菜碱含量测定

2.4.4生理生化指标的测定

第三章结果

3.1棉花T3代转基因植株的分子检测

3.2转betA基因棉花的耐盐性分析

3.2.1不同盐浓度下棉花种子的萌发率及棉花幼苗的高度

3.2.2不同NaCl浓度下棉花叶片中甜菜碱的含量

3.2.3不同NaCl浓度下棉花生理生化指标的变化

3.2.4转基因植株的农艺性状和产量

3.3转betA基因棉花的耐低温性分析

3.3.1低温胁迫下棉花种子的萌发率

3.3.2低温胁迫下棉花叶片中甜菜碱的含量

3.3.3低温胁迫下棉花苗期生理生化指标的变化

第四章讨论

4.1植物中甜菜碱的含量

4.2转胆碱脱氢酶基因棉花植株的耐盐性

4.3转胆碱脱氢酶基因棉花植株的耐低温性

4.4结论

参考文献

致谢

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