牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化

摘要

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是充分发挥了自身的不断扩增能力、自身持续更新特点和可以向多个方向诱导分化的一种干细胞。它最早发现于骨髓中，随后相继在羊膜、羊水、外周血、肌肉等组织部位中也被发现。但目前研究工作主要集中在人、大鼠、小鼠骨髓中的研究，关于牛胎儿的MSCs研究报道较少，尚没有关于牛胎儿早期骨骼肌来源的MSCs的研究报道。本实验以牛胎儿骨骼肌来源的MSCs为研究对象，对其分离培养、鉴定和诱导分化进行了初步探索，结果如下:
　　1.以荷斯坦牛胎儿骨骼肌组织为材料，采用Ⅳ型胶原酶消化方法，在体外环境中分离得到了荷斯坦牛胎儿骨骼肌来源MSCs，显微镜下观察其生长旺盛，具有典型的长梭形状或不规则的三角形形态，细胞胞质丰满，空间立体感较强，当细胞涨满整个培养皿时会呈现出一种旋涡状。细胞传代至25代，共计有75支细胞被冻存到液氮中。
　　2.利用免疫荧光技术鉴定牛胎儿骨骼肌来源MSCs特异性表面标志基因CD106、CD29、CD44结果为阳性表达，CD34结果为阴性表达。这满足MSCs表面特异性标志物的特性。
　　3.采用RT-PCR检测P3、P8、P13代牛胎儿早期骨骼肌来源MSCs特异性表面标志基因CD44、CD29、CD73、CD90、CD166结果为阳性表达，CD34、CD45结果为阴性表达。符合MSCs标志物的本身所应有的表达情况。
　　4.牛胎儿骨骼肌来源的MSCs经过IBMX、胰岛素、地塞米松和吲哚美辛的联合诱导后形成含有淡黄色发亮脂滴的脂肪细胞，油红O染色结果可清晰看到红色脂滴，RT-PCR检测结果可清楚看到其表达PPAR-γ、转录因子C/EBPδ、FABP4。结果表明，胎牛骨骼来源MSCs是有一定分化能力的干细胞。
　　5.牛胎儿骨骼肌来源的MSCs在5％马血清、地塞米松和氢化可的松诱导下，形成具有多核肌管的成肌细胞，免疫荧光染色技术和RT-PCR技术鉴定表明，成肌细胞分化的特异性标志因子fast skeletal myosin呈阳性表达。结果显示，牛胎儿骨骼肌来源MSCs具有一定的多向分化潜能。
　　试验结果表明，牛胎儿骨骼肌来源的间充质干细胞可以在体外分离培养，经过多次传代仍然具有增殖等能力，还具有向脂肪细胞、成肌细胞诱导分化的能力。本研究初步构建了牛胎儿早期骨骼肌来源的间充质干细胞的分离方法、培养体系、为细胞鉴定及诱导方法和试验流程奠定了基础。

目录

摘要

论文说明

缩略语表

1 引言

1．1 间充质干细胞的起源及在不同组织中的发展状况

1．2 间充质干细胞的分离方法、培养体系和标志因子鉴定

1．2．1 间充质干细胞的分离方法

1．2．2 间充质干细胞的培养体系

1．2．3 间充质干细胞标志因子的鉴定

1．3 间充质干细胞在体内和体外的分化潜能

1．3．1 MSCs在体内的研究

1．3．2 MSCs在体外的研究

1．4 间充质干细胞未来的应用

1．4．1 间充质干细胞替代治疗手段的应用

1．4．2 间充质干细胞临床基因治疗手段的应用

1．5 本研究的目的和意义

2 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的分离培养及鉴定

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 试验主要仪器设备及耗材

2．1．3 试验主要试剂

2．1．4 试验主要试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞分离培养

2．2．2 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的传代培养

2．2．3 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的冻存与复苏

2．2．4 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的免疫荧光鉴定

2．2．5 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的RT-PCR鉴定

2．3 结果

2．3．1 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的取材

2．3．2 牛胎儿早期骨骼肌来源问充质干细胞的分离培养

2．3．3 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞传代培养及细胞形态

2．3．4 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的冻存与复苏

2．3．5 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的免疫荧光鉴定

2．3．6 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的RT-PCR鉴定

2．4 讨论

2．4．1 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞分离培养

2．4．2 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞传代培养

2．4．3 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的冻存与复苏

2．4．4 牛胎儿早期骨骼肌来源问充质干细胞的鉴定

2．5 本章小结

3 牛胎儿早期骨骼肌来源间充质干细胞的诱导分化及鉴定

3．1 试验材料

3．1．1 试验对象

3．1．2 试验主要仪器设备及耗材

3．1．3 试验主要试剂

3．1．4 试验主要试剂配制

3．2 试验方法

3．2．1 牛胎儿早期骨骼肌来源MSCs向成脂细胞诱导分化及鉴定

3．2．2 牛胎儿早期骨骼肌来源MSCs向成肌细胞诱导分化及鉴定

3．3 试验结果

3．3．1 向成脂诱导

3．3．2 向成肌诱导

3．4 讨论

3．4．1 牛胎儿早期骨骼肌来源MSCs向成脂细胞诱导分化及其鉴定

3．4．2 牛胎儿早期骨骼肌来源MSCs向成肌细胞诱导分化及其鉴定

3．5 本章小结

4 全文结论

参考文献

致谢

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