胎盘血管病变发病机理的研究

摘要

胎盘血管病变可导致妊娠结局不良，其中包括大多数的产前胎儿并发症，如胎儿宫内发育受限(IUGR)，以及远期的胎儿并发症如小脑麻痹，而且还与母体的妊娠高血压综合征(PIE)有关。临床研究显示此病变可以被脐动脉多普勒超声检查所识别和诊断，但此病变及其胎儿并发症的病因及发病机理至今未明。 初步的研究显示在胎盘血管病变的胎儿中存在有血小板的激活并认为与内皮细胞损伤有关，因此对内皮细胞的功能性研究在胎盘血管病变的发生中成为关注的焦点。研究表明胎盘绒毛的微血管内皮细胞激活和受损在胎盘血管病变的发病机制中起到关键性的作用，而且这种组织对损伤的反应可能是一种炎性反应。最近的研究表明胎儿的炎性反应、感染和先天性免疫反应与胎盘血管病变相关。最新资料显示IUGR患儿在成年后动脉粥样硬化、心血管疾病和代谢性疾病的发病率显著升高。 动脉粥样硬化是血管内皮对损伤的反应，同时伴有单个核细胞、细胞因子、生长因子、脂蛋白的聚集以及细胞间基质的异常表达，并与感染、炎症和先天性免疫反应相关。而且在胎盘血管病变的胎儿循环中也存在着可导致成人动脉粥样硬化相同的危险因子及基因易感性。 本研究通过应用分子生物学及免疫学技术将进一步阐明微血管内皮激活与受损、炎性反应以及免疫反应在围产期发病中的重要意义，探讨胎盘血管病变与成人动脉粥样硬化疾病的相关性，希望发现与此病发生有关的基因与信号传导路径，试图寻求免疫及基因调控措施、达到对妊娠结局不良的预防与治疗。 第一部分：胎盘血管病变与正常妊娠人类基因组差异表达的研究 目的：胎盘血管病变可能导致人类妊娠并发症以及结局不良。临床研究显示此病变可以被脐动脉多普勒超声检查所识别和诊断。近来的研究表明在胎盘血管病中存在胎盘绒毛的微血管内皮细胞激活和促炎的细胞因子应答。并且胎盘内皮细胞激活和受损已被证明是胎盘血管病变的一个特征。虽然为了阐明该病的发病机制已经做了大量的研究，但此病变及其胎儿并发症的病因及发病机理至今未明。本研究应用22人类基因组寡核苷酸芯片，筛选了胎盘血管病患者和正常妊娠者胎盘组织中的差异表达基因，并应用实时定量聚合酶链反应(PCR)验证了部分差异基因的表达，进行了分子生物信息学分析，探讨差异基因群与胎盘血管病之间可能存在的联系，并将以此为切入点研究胎盘血管病的发生机制。 　　材料与方法： 　　1.标本收集　　2.人类基因组寡核苷酸芯片(22K)*胎盘组织总RNA的提取*对样品RNA进行荧光标记*芯片杂交前预处理*杂交与清洗*芯片扫描*芯片图像的采集与数据分析3.提取RNA，进行实时定量PCR4.统计学分析结果： 一、芯片结果信息比较分析经过两张芯片间差异基因表达的比较，我们发现在胎盘血管病中存在10个基因表达水平显著改变≥2或＜0.5，它们包括SNFT，SLC18A2，MT1H，MTIX，HSPA6，HSPA1A，MT1E，MT1L，SSI-1和H1F0，这些基因中大多数为信号传导因子，其中有9个在胎盘血管病中上调，只有1个下调。 二、实时定量PCR结果分析4个差异基因在胎盘血管病与正常胎盘中的表达通过定量PCR检测。经过数据统计分析，它们在患有胎盘血管病的胎盘组织中的表达均较正常胎盘组织中的表达升高，与芯片结果一致。 结论：胎盘血管病是一种炎性疾病，具有血管壁内皮细胞激活的特征。HSPA1A,HAPA6，MT1L，MT1E，MT1H和MTIX在细胞抵抗氧化应激中可能作为第二类抗氧化剂起到保护作用。SLC18A2在胎盘血管床中也可能作为一种保护机制预防血管收缩从而保证为胎儿提供稳定的血流。SSI-1和SNFT可能抑制细胞因子的信号传导，而H1FO可能参与了转录活性和细胞分化的调控。总之，这些基因有可能通过转录因子的活化参与了内皮细胞激活。 第二部分：胎盘血管病变发病的相关因子在胎盘组织及微血管内皮细胞中表达的研究 目的：胎盘循环中的血管病变可以导致人类妊娠的并发症(如：PIE)和妊娠结局不良(如：IUGR，胎儿宫内窘迫等)。在胎盘组织的母体-胎儿面致炎和抗炎的细胞因子至少部分参与病变的发生。最近的研究表明在胎盘血管病变中胎儿的感染和炎性反应与先天性免疫反应相关。并且已经有直接的证据证明在胎盘血管病变中存在胎盘绒毛的微血管内皮细胞激活和炎性因子的应答。研究表明胎盘中内皮细胞受损和激活是胎盘血管病变的一个特征。在本研究中，我们选择与血管病变及炎性疾病发病关系密切的因子如：热休克蛋白(HSP)和白介素(IL)进行了检测，以探讨它们在该病发生发展中的作用及机制。 材料与方法： 1.标本收集 2.免疫组织化学3.应用标记CD3 1的免疫磁珠分离纯化胎盘微血管内皮细胞4.提取RNA，进行实时定量PCR5.蛋白提取与蛋白印记分析(Western-blot)6.统计学分析结果： 1.免疫组化结果分析结果发现在胎盘微血管中HSP27和HSP70主要表达在内皮细胞和平滑肌细胞，在研究组和对照组均较强；IL-10的表达非常弱，而且阳性结果较少，无法进行对比分析；而IL-18的表达却主要限于内皮细胞，且较弱，经过比较可以得出实验组较对照组表达阳性明显增强。 2.胎盘微血管内皮细胞的鉴定从胎盘绒毛的微血管分离后，结合有标记CD31免疫磁珠的内皮细胞，用vWF抗体验证其纯度达到90％以上。 3.实时定量PCR结果分析我们通过定量PCR检测了HSP27、HSP70、IL-10和IL-18在胎盘组织及微血管内皮细胞中的表达。IL-10经过反复多次试验，无论在胎盘组织还是血管内皮细胞(包括观察组及对照组)均未扩增出目的条带，因此无法进行对比定量分析；无论是胎盘组织中还是微血管内皮细胞中，实验组较正常组HSP27、HSP70和IL-18的表达均上调(P＜0.05)。 4.Western-blot结果分析为了比较HSP27和HSP70蛋白的表达，我们进行了Western-blot。结果显示在胎盘组织及微血管内皮细胞中，实验组较正常组HSP27和HSP70的表达均上调(P＜0.05)。 5.临床结果分析实验组的孕妇分娩较早，婴儿出生体重也减轻，在这组中出生体重相对胎龄的百分数也是减低的。经过相关分析，IL-18的表达与孕妇身高呈负相关，与宫高和胎儿身高呈正相关(P＜0.05)；HSP27的表达与胎次、胎儿体重和出生体重相对胎龄的百分数呈负相关(P＜0.05)；HSP70的表达与胎儿出生时的体重呈负相关(P＜0.05)；IL-18和HSP27的表达呈正相关(P＜0.05)；HSP27和HSP70的表达也呈正相关(P＜0.05)。 结论：IL-18、HSP27和HSP70与胎盘血管病的发病机制相关，并认为热休克蛋白作为转录因子通过多渠道对IL-18的信号传导起调节作用。IL-18、HSP27和HSP70在胎盘微血管内皮细胞中表达的升高进一步导致胎盘组织中的升高。本研究为胎盘血管病中炎症应答和内皮损伤的重要性提供了进一步的证据。我们推测IL-18以及其他相关细胞因子可作为介质导致内皮受损和炎性应答，并参与了胎盘血管病的发生和发展。 第三部分：CD4+CD25+调节性T细胞在胎盘血管病变中的研究 目的：近代生殖免疫学研究认为，妊娠是一种成功的半同种移植，妊娠的成功有赖于妊娠妇女对胚胎半同种抗原所表现的一种免疫耐受。最近的研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)可能是诱导母胎免疫耐受的主要因素。Treg是不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞群体，是机体以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。转录因子Foxp3(叉状头/翅膀状螺旋回转录因子)是维持CD4+CD25+Treg发育和功能的重要调节基因，在正常人中可作为CD4+CD25+Treg的特异性鉴定标志。本研究拟通过流式细胞术检测胎盘血管病与正常孕妇外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达率，以探讨Treg在胎盘血管病发病中的作用。 材料与方法： 1.留取标本：实验组与对照组孕妇分别取外周血2ml，均用EDTA抗凝； 2.分离单个核细胞：用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞； 3.流式细胞术：检测新鲜单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg的表达率； 4.统计学分析结果：试验组与对照组相比较，CD4+细胞率P值＜0.05，存在显著性差异；CD25+/CD4+、Foxp3+/CD4+和CD25+Foxp3+/CD4+细胞率，P值均＞0.05，提示无显著性差异。 结论：本研究尚未发现CD4+CD25+Foxp3+Treg在胎盘血管病组与正常妊娠组之间存在显著差异表达，可能与观察例数受限有关，因此对于免疫耐受是否参与胎盘血管病的发病机理仍需要开展进一步的大样本研究。

目录

论文说明：缩略语表

声明

第一部分胎盘血管病变与正常妊娠人类基因组差异表达的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附录

参考文献

第二部分胎盘血管病变发病的相关因子在胎盘组织及微血管内皮细胞中表达的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附录

参考文献

第三部分CD4+CD25+调节性T细胞在胎盘血管病变中的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

Endothelial Injury and Risk Factors are Associated with Placental Vascular Diseases(Review)

致 谢

攻读学位期间发表的论文

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