MiRNA378/MiRNA378*通过网腔钙结合蛋白介导阿霉素损伤心肌细胞保护作用的机制研究

摘要

目的：
　　探究阿霉素损伤心肌细胞中miRNA378/miRNA378*、Calumenin、内质网应激和心肌细胞凋亡的相互关系和调控机制，寻求阿霉素心肌病治疗新途径。
　　方法：
　　本实验采用原代培养的乳鼠心肌细胞，随机分为对照组、阿霉素组、过表达对照组、miRN A378过表达组、miRN A378*过表达组、沉默对照组、miRN A378沉默组、miRN A378*沉默组。实验分为三个部分：
　　1、采用实时荧光定量-聚合酶链反应（Real-time PCR）技术检测阿霉素损伤心肌细胞miRNA378/miRNA378*表达量；
　　2、采用慢病毒转染技术过表达 miRNA378/378*，Real-time PCR技术检测心肌细胞中miRNA378/378*表达量以评估转染效率，检测Calumenin、内质网应激伴侣蛋白GRP78、内质网应激-凋亡信号通路因子PERK、eIF2a、ATF4mRNA表达量，采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测Calumenin、GRP78、PERK、P-PERK、eIF2a、P-eIF2a、ATF4蛋白表达量，Tune l检测心肌细胞凋亡；
　　3、再通过慢病毒转染技术沉默 miRNA378/378*，检测上述指标表达量的变化，进行反向验证。
　　结果：
　　1、与对照组相比，阿霉素组miRNA378/378*表达量明显减少，有统计学意义（p<0.05）；
　　2、与阿霉素组相比，过表达miRNA378/378*组Calumenin表达增加，内质网应激伴侣蛋白及内质网应激-凋亡信号通路相关因子表达量减少，心肌细胞凋亡显著减少，有统计学意义（p<0.05）；而沉默miRNA378/378*组，Calumenin表达减少，内质网应激增加，细胞凋亡增多，有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：
　　在阿霉素损伤的心肌细胞中，miRNA378和miRNA378*可能通过上调Calumenin表达，缓解内质网应激及其介导的心肌细胞凋亡信号通路的活化，减少心肌细胞凋亡。增加miRN A378和miRNA378*的表达可能成为改善阿霉素心肌病患者心脏功能，提高其生活质量的新方法。

目录

缩 略 语 表

1 引言

2 实验材料与方法

2.1实验动物

2.2 主要试剂与仪器

2.2 主要仪器

2.3 心室肌细胞的分离与鉴定

2.4 心室肌细胞培养

2.5 构建慢病毒质粒[24]

2.6 慢病毒感染与加药

2.7 Real-time PCR检测miRNA378/378*以及内质网应激伴侣蛋白GRP78、内质网应激-凋亡信号通路相关因子PERK、eIF2a、ATF4 mRNA相对表达量的变化[25]

2.8 Western blot技术检测Calumenin、GRP78、PERK、P-PERK、eIF2a、P-eIF2a、ATF4蛋白表达量的变化[26]：

2.9 TUN EL染色法检测心肌细胞凋亡[27]：

2.10 统计学方法

3 实验结果

3.1 心室肌细胞光镜形态鉴定、α-SMA染色鉴定结果

3.2 Real-time PCR检测阿霉素损伤心肌细胞miRNA378/378*表达量：

3.3 Real-time PCR检测慢病毒转染心肌细胞miRNA378/378*表达量

3.4 Real-time PCR检测相关mRNA表达

3.5 Western blot检测相关蛋白表达

3.6 TUN EL法检测各组原代培养乳鼠心肌细胞凋亡

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:阿霉素心肌病研究进展

致谢

作 者 简 介

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