PRC1在细胞胞质分裂过程中作用机理的研究

摘要

真核细胞的细胞周期是由一系列细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)精确地调控着，同时，该类蛋白激酶的活性又是由与其结合的各种不同细胞周期蛋白(Cyclins)调控。细胞有丝分裂时期的最重要调控因子是CDK1/CyclinB1蛋白激酶复合体。该蛋白激酶复合体对相应底物的磷酸化作用控制着细胞有丝分裂时期各种结构的形成以及有丝分裂过程的正常进行。 细胞有丝分裂过程中，由骨架蛋白—微管蛋白(tubulin)形成的特异性纺锤体结构对姐妹染色体的分离以及细胞最终分裂起着至关重要的作用。在有丝分裂中期与后期之间，从纺锤体两极延伸到细胞中央的微管紧密地结合捆束在一起，形成指状交叉的纺锤体中央区结构(spindle midzone)。该结构对细胞胞质分裂阶段，分裂沟的形成及收缩以致细胞最终完全分裂发挥无可比拟的作用。 PRC1蛋白最初是在体外寻找CDK蛋白激酶的作用底物时发现，进而被证实在细胞有丝分裂期可以被CDK1/CyclinB1蛋白激酶磷酸化。随后，PRC1又被证实可以在体内、体外结合捆束微管结构(binding and bundling microtubules)，显示该蛋白分子与细胞有丝分裂时期纺锤体(mitotic spindle)形成及功能密切相关。应用显微注射抗体或细胞转染小分子干扰RNA技术抑制PRC1的正常功能，导致细胞不能完成正常分裂，形成双核细胞，说明PRC1蛋白分子作用在细胞分裂的最后阶段一胞质分裂期(cytokinesis)。同时，我们早期的研究证实PRC1蛋白分子可以结合驱动蛋白分子Kif4，因而在纺锤体上被转运至纺锤体中央区，并且该转运是由PRC1蛋白分子的磷酸化/去磷酸化精确的调控。然而，PRC1蛋白究竟在细胞胞质分裂时期发挥什么样的作用，又是如何发挥这些作用。其具体调控机制目前尚不完全清楚，仍有待于进一步调查研究。 本课题研究是在以往研究的基础上，通过分析微管结合与捆束蛋白PRC1的蛋白分子结构功能特性，探讨其在纺锤体中央区形成过程的作用；在此基础上，深入研究CDK1/cyclinB1蛋白激酶磷酸化对PRC1蛋白功能的调控。通过大量的分子生物学以及细胞生物学实验研究，最终明确PRC1在细胞有丝分裂过程中的调控途径，进而阐明细胞有丝分裂时期纺锤体中央区的形成机制。 目的： 通过分析PRC1蛋白分子的结构特性，研究PRC1蛋白的生物学特性并结合其在细胞内的功能作用，探讨PRC1对细胞有丝分裂纺锤体中央区(spindle midzone)结构形成的决定性作用。 方法： 1.通过体外细菌诱导表达PRC1蛋白，经层析柱分离获得PRC1聚合体； 2.通过体内共转染表达带有不同标记的PRC1蛋白或其缺失突变体，经免疫共沉淀试验鉴定PRC1自身聚合的功能区； 3.通过蔗糖密度梯度离心非同步化细胞裂解物，分析细胞内源性PRC1形成多聚体；再应用抗磷酸化PRC1抗体分析检测磷酸化PRC1的分布情况； 4.通过细胞免疫荧光染色技术，对细胞内磷酸化的PRC1进行定位分析； 5.应用小分子RNA干扰技术，对细胞内PRC1的功能进行研究； 6.应用细胞内表达外源性相关蛋白对小分子RNA的干扰作用实行解救(rescue)： 7.应用活细胞跟踪摄像技术(livingcellimaging)观察细胞内过表达CyclinB1△90对PRC1以及纺锤体的影响； 8.应用计算机软件重建纺锤体的三维立体结构(3Dreconstruction)，进而更清晰地观察研究细胞内纺锤体的结构变化。 结果： 1.经体内、体外试验证实，PRC1蛋白分子可以形成自身多聚体(四聚体，tetramer)； 2.经真核细胞表达质粒共转染试验证实，PRC1蛋白分子的自身聚合功能区位于氨基端184个氨基酸； 3.经蔗糖密度梯度离心试验证实，细胞内源性PRC1蛋白分子可以形成多聚体，然而磷酸化的PRC1蛋白不能形成多聚体； 4.经小分子RNA干扰及其解救实验证实，PRC1蛋白是纺锤体中央区形成的必须蛋白; 5.经小分子RNA干扰试验证实，PRC1蛋白聚合捆束微管的生物学功能不依赖于其结合蛋白Kif4。 结论： 1.PRC1在体内、体外均可以形成自身多聚体； 2.PRC1在有丝分裂早期的磷酸化状态抑制该蛋白分子形成自身多聚体； 3.PRC1自身多聚体特性在有丝分裂时期纺锤体中央区的形成发挥巨大的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分　PRC1蛋白分子的自身多聚体化(Ollgomerization)

第二部分　PRC1在细胞内的自身聚合及其磷酸化的调节

第三部分　PRC1决定细胞有丝分裂时期纺锤体中央区的形成

第四部分 PRC1自身聚合对细胞有丝分裂的调节

结论

参考文献

致谢

发表的学术论文目录

附录：已发表的外文论文(一)

附录：已发表的外文论文(二)