甲状腺乳头状癌浸润前沿癌细胞极性丧失/粘附性下降与periostin的表达及临床预后的关系

摘要

背景与目的: 甲状腺乳头状癌是人体最常见的内分泌恶性肿瘤。甲状腺癌患者的预后较好，术后10年无病生存率约为90％，但仍有10％的患者出现术后癌复发、远处转移甚至因癌死亡。研究表明，手术时甲状腺外浸润的出现与患者术后的不良预后密切相关。因此，发现影响甲状腺乳头状癌发展和浸润的分子水平的变化，对甲状腺乳头状癌的治疗具有重要应用意义。 最近，一个新基因periostin，又称osteoblast specific protein2（OSF-2）被连续报道在一系列癌的生长，血管生成，浸润及转移中起重要角色，包括甲状腺乳头状癌。在乳腺癌培养细胞及小鼠种植瘤实验中，periostin的高表达可导致血管内皮生长因子2的高表达，从而推动癌的进展和血管生成；在肺非小细胞癌中，患者血清中periostin的高水平与不良临床预后之间有显著统计学意义；在甲状腺乳头状癌组织中，periostin的高表达与癌的甲状腺外浸润、淋巴结转移和癌的高进展阶段相关。进一步研究发现，将periostin基因导入到293T癌细胞后，癌细胞会出现上皮细胞间质转化，从而侵袭活性增强。有报道表明，在鳞状细胞癌培养细胞中，上皮细胞间质转化表型的癌细胞，其periostin的表达量远高于上皮表型的癌细胞。上皮细胞间质转化是癌浸润转移过程中的一个普遍现象，其特征为浸润前沿部癌细胞上皮特性的丧失和间质特性的获得，包括形态学方面癌细胞极性缺失和/或粘附性下降，及分子水平E-cadherin表达下降，vimentin、上皮生长因子受体、间质金属蛋白酶-9、TGF-β、NFkβ表达上调等。然而，在甲状腺乳头状癌中，作为上皮细胞间质转化形态学特征的癌细胞极性缺失和/或粘附性下降与其他临床病理指标的关系，包括与甲状腺外浸润及淋巴结转移的关系仍然未知；与periostin表达的关系也依然未知。 到目前为止，人体组织中periostin共有五种isoform被报道。这五种isoform的差异位于外显子XV1-XX11（对应于periostin蛋白的C端），由转录水平mRNA的选择性剪接（alternative splicing）造成。在膀胱癌组织和正常组织中，有不同的periostin isoform表达，因此periostin isoform的表达方式被认为与膀胱癌的发生有关。periostin isoform在甲状腺组织，包括癌组织和非癌组织中的表达尚未有道。 本研究拟解决以下几个问题：（1）甲状腺乳头状癌浸润前沿癌细胞极性缺失和/或粘附性下降与其它临床病理学指标（性别、年龄、癌的大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移等）的关系及其对临床预后的影响。（2）甲状腺乳头状癌浸润前沿癌细胞极性缺失和/或粘附性下降与periostin表达的关系。（3）periostin isoform在甲状腺癌组织及非癌组织中的表达方式及其与甲状腺癌的发生或发展的关系。 方法: 1．将68例甲状腺乳头状癌癌组织及其周围组织用甲醛固定，石蜡包埋，制成HE切片，检测浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的情况，并用X2检验或Fisher's精确概率检验检测其与其它临床病理学指标（性别、年龄、癌的大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移等）的关系。 2．提取1中所述病例的甲状腺癌组织及其背景甲状腺非癌组织的全RNA，逆转录成cDNA，用RT-PCR法检测是否有periostin表达。用Taqman的探针和引物，采用real-time PCR法检测periostin在甲状腺组织的定量表达。β-actin为内对照。periostin在甲状腺乳头状癌癌组织和对应的非癌组织中的差异用△△Ct法计算，表示为T/N比（T：癌组织；N：非癌组织）。用X2检验或Fisher's精确概率检验检测periostin的表达与浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降及其它临床病理学指标（性别、年龄、癌的大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移等）的关系。 3．设计能够扩增periostin cDNA全长的几对引物，通过RT-PCR法获得扩增的目的DNA片段，并用琼脂糖凝胶跑电泳。将同一胶上不同长度的DNA目的片段分离，纯化，用DNA测序法检测periostin isoform在甲状腺癌组织、非癌组织及癌细胞株中的表达情况，并检测periostin isoform的表达方式与甲状腺癌的发生或癌的进展有无关联。 4．对181例有临床预后资料的甲状腺乳头状癌患者（癌直径<10mm或手术时有远处转移的除外）进行回顾性分析，调查手术时患者的基本情况以及癌的临床病理学指标，包括性别、年龄、癌的大小、有无甲状腺外浸润、淋巴结转移、pT（UICC的TNM分类）、stage grouping（UICC的TNM分类）、手术断端有无癌等。阅览手术切除标本的HE切片，观察浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的情况。用Kaplan-Meier法和log-rank检验检测浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的情况对患者无病生存率的影响，以及各个临床病理学指标在单因素生存分析中的意义。对在单因素分析中有显著性统计学意义的因素用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。 结果: 1．68例甲状腺乳头状癌中，浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降阳性的病例为42例（61．8％）。癌细胞极性缺失和/或粘附性下降与癌的甲状腺外浸润（P=0．0085），pT高值（P=0．0437）及淋巴结转移（P=0．0015）呈正相关；与患者的年龄，性别及肿瘤大小之间无统计学意义（P>0．05）。 2．periostin的表达用T/N比表示，以T/N=4为临界值，在68例甲状腺癌患者中有26例（38．2％）患者T/N>4，有42例（61．8％）患者T/N≤4。Periotin的高表达（T/N>4）与癌浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降有显著统计学意义（P<0．0001）；Periotin的高表达（T/N）4）与癌的甲状腺外浸润（P=0．0005），pT高值（P=0．0015）及淋巴结转移（P=0．0246）呈正相关。 3．在人体甲状腺非癌组织、乳头状癌组织、滤泡癌组织、未分化癌组织、乳头状癌培养细胞、滤泡癌培养细胞及未分化癌培养细胞中，periostin isoform的表达方式相同，都有8个isoform被表达。其中5个isoform已被报道，3个是新发现。这8个isoform与野生型periostin相比，在外显子XVⅡ～XXⅠ中有选择性序列缺失，但这些序列缺失并未引起读码框的移动。3个新isoform的特点分别为外显子XVⅡ+XVⅢ，XVⅡ+XXⅠ，XVⅡ+XVⅢ+XIX全部核苷酸序列的缺失。它们的cDNA序列已被基因库（Genbank）收录，编码为：EU262883，EU262884和EU262886。3个新isoform中有两个之前未在任何种类和任何组织中被报道。 4．在181例甲状腺乳头状癌患者中，癌浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的阳性率为71．0％，他们的随访时间为131±47（mean±s．d．）月。Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验显示浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的出现与不良临床预后成正相关（P=0．0229）。同时，结果1中浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降与癌的甲状腺外浸润，pT高值及淋巴结转移的关系用这批病例得到了又一次验证。 5．在单因素分析中，浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降、患者年龄、肿瘤大小、甲状腺外浸润、淋巴结转移、pT、stage grouping及手术断端是否阳性对患者的无病生存有显著性影响：在多因素分析中，只有患者年龄和肉眼淋巴结转移是影响患者无病生存的独立变量。 结论: 1．在人体甲状腺乳头状癌中，作为癌上皮细胞间质转化形态学特点的浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的出现与参与癌上皮细胞间质转化过程的分子periostin的高表达有显著的统计学相关性。浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降的出现与癌的甲状腺外浸润，pT高值及淋巴结转移呈正相关。生存分析显示，浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降阳性的患者其无病生存率明显低于阴性患者。本研究有效地阐述了甲状腺乳头状癌中periostin的表达，浸润前沿部癌细胞极性缺失和/或粘附性下降这一形态学表现，以及患者的临床预后三者之间的相关性。 2．人体甲状腺非癌组织、乳头状癌组织、滤泡癌组织、未分化癌组织中，不管是否有甲状腺外浸润或淋巴结转移，periostin isoform的表达方式相同，均有8个isoform同时被表达。这说明periostin isoform的表达方式与甲状腺癌的发生或癌的进展无关。 3．本实验发现了人体组织中3个新的periostin isoform，其中有两个未在其他任何生物中报道。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分甲状腺乳头状癌浸润前沿细胞极性丧失/粘附性下降与periostin表达的关系

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分甲状腺乳头状癌浸润前沿癌细胞结合力下降/极性丧失的发现及其与临床预后的关系

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分Periosin isoform在甲状腺组织中的表达及新isoform的发现

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

创新点及局限性

全文小结

附图表

致 谢

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发表论文二