奶牛乳腺炎无乳链球菌Hly基因主要抗原表位的截短序列表达及抗原性研究

摘要

目的：截短克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌Hly基因抗原优势区域，构建重组表达载体，实现原核高效表达，进而研究表达蛋白的抗原性，为研究其致病机制及溶血素抗原蛋白的研发提供实验基础和理论依据。
　　方法：根据GenBank公布的牛源无乳链球菌[CP018623.1]溶血素基因序列设计与合成引物，以牛乳源性无乳链球菌1886菌株基因组DNA为模板，利用PCR技术获得hly溶血素基因片段，经转入到原核表达载体pET-30a（+）中，构建重组质粒pET-30a-Hly，测序正确后，将其转化到E.coli/BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE电泳，Bandscan软件分析表达蛋白图谱，利用Western-blot试验验证重组蛋白的反应原性。利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，经鲜血琼脂培养基检测是否具有溶血活性，在经水溶性501佐剂乳化后免疫昆明小白鼠，探索其免疫原性，并建立检测免疫抗体滴度的间接ELISA。
　　结果：经测序和酶切结果表明，成功克隆了奶牛乳腺炎无乳链球菌1886菌株Hly溶血素基因，并成功构建了原核表达重组质粒，实现原核高效表达，表达主要形式以包涵体沉淀，重组蛋白分子量约为30Ku，蛋白复性后经纯化，蛋白含量达到1.2 mg/mL。Western-blot结果表明，重组蛋白具有良好的反应原性，间接ELISA检测免疫抗体滴度结果表明，表达蛋白具有良好的免疫原性，间接ELISA可检测到最低效价达1:25600。
　　结论：经Western-blot分析与间接ELISA检测,结果表明内蒙古地区临床分离无乳链球菌1886野生菌株溶血素Hly基因，抗原表位优势序列编码的多肽具有抗原性，可以作为候选免疫抗原，为研究其致病机制及新型疫苗奠定良好的实验基础。

目录

英文缩写词表

1引言

1.1牛乳腺炎常见致病菌研究进展

1.2溶血素（Hemolysin）概述及研究进展

1.3奶牛乳腺炎的分类和诊断方法

1.4奶牛乳腺炎的治疗

1.5无乳链球菌疫苗研究进展

1.6研究的目的和意义

2主要实验材料

2.1实验菌株和表达载体

2.2实验动物

2.3主要试剂

2.4主要仪器

2.5实验技术路线

3目的基因阶段克隆和表达质粒的制备

3.1溶血素基因主要抗原表位区域的分析及引物设计

3.2菌种的复苏及总DNA模版的提取

3.3 hly溶血素基因抗原优势区域的PCR扩增

3.4产物的胶回收

3.5重组pET30a(+)-Hly表达载体的构建

4 Hly溶血素基因的截短序列表达

4.1重组表达质粒与工程菌的转化及鉴定

4.2重组hly溶血素基因的截短抗原表位序列的表达

4.3表达产物的可溶性分析

4.4表达产物复性

4.5复性产物纯化

4.6 Hly重组蛋白含量的定量

4.7诱导表达条件的优化

4.8重组Hly基因亚单位疫苗的溶血活性检测

5重组hly溶血素蛋白的Western blot分析

5.1Hly溶血素蛋白制备

5.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

5.3蛋白质印迹法（Western blot）转膜与显色

6小鼠多克隆抗体的制备

7检测免疫抗体效价的间接ELISA方法建立

7.1间接ELISA法测定抗体水平的步骤

7.2间接ELISA最佳反应条件的优化

8实验结果

8.1溶血素基因主要抗原表位区域的分析

8.2无乳链球菌总DNA的提取及PCR产物的扩增

8.3重组载体的酶切鉴定及测序

8.4溶血素基因的截短表达、纯化及可溶性分析

8.5重组Hly表达产物的溶血活性鉴定

8.6截短表达Hly蛋白的Western blot鉴定

8.7检测免疫抗体效价的间接ELISA方法建立

9讨论与分析

10实验结论

参考文献

致谢

作者简介

声明