TIPE2在鼠动脉硬化斑块和人多种组织细胞中的表达及其意义

摘要

目的： 动脉粥样硬化是一种累及血管壁的慢性炎症性疾病。免疫细胞参入了整个炎症过程，TIPE2作为一种新的免疫负调控分子是否参与了动脉粥样硬化斑块的形成过程？目前尚未见报道。已有的研究显示内皮细胞功能失常是动脉粥样硬化发生的始动因素，那么内皮细胞是否表达TIPE2尚不清楚。为了研究TIPE2表达特点及其与疾病的关系，本研究首先利用小鼠动脉粥样硬化模型检测TIPE2在动脉粥样硬化形成过程中的表达规律，分析了TIPE2表达与细胞因子的关系；在此基础上又发现人TIPE2不仅表达于免疫细胞，而且在人血管内皮细胞等非免疫细胞中也有表达。另外，我们经由武汉博士德生物工程公司制备了兔抗人TIPE2的多克隆抗体，并对其在正常人多种组织中和溃疡性结肠炎患者结肠局部的表达情况进行了检测，为深入研究人TIPE2的生物学特点与功能奠定了基础。 方法： 1．TIPE2及细胞因子在鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达 应用ApoE-/-小鼠构建动脉血管粥样硬化模型，普通C57野生型小鼠为对照组，通过对动脉血管HE染色及油红O染色判定斑块进展情况；并用RT-PCR的方法检测斑块局部TIPE2及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12p40（IL-12p40）、转化生长因子-β（TGF-β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。 2．TIPE2在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的表达及诱导 采用0．125％胰酶+0．01％EDTA消化液从新生儿脐带中分离培养人脐静脉内皮细胞，并用免疫细胞化学的方法检测八因子相关抗原（Ⅷ-R Ag）的表达，鉴定所培养的细胞为人脐静脉内皮细胞后，在M199+20％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+贝复济的完全培养基中培养至4-10代用于实验研究；应用RT-PCR的方法检测TIPE2和黏附分子（ICAM-1和VCAM-1）的表达水平，通过免疫细胞化学的方法检测培养的内皮细胞中TIPE2的基础表达情况；应用免疫组织化学的方法检测正常人主动脉中TIPE2的表达情况；给予内皮细胞TNF-α和oxLDL刺激及去除血清诱导内皮细胞凋亡后，分析影响内皮细胞中TIPE2表达的因素。 3．兔抗人TIPE2多克隆抗体的制备和应用 根据人TIPE2晶体结构的研究结果及同源性分析，并结合抗体设计筛查软件在第一个α螺旋结构前选择人TIPE2蛋白特异的片段，由公司合成多肽后与载体交联构建半抗原-载体偶联物，免疫新西兰兔，分离血清后应用亲和层析法纯化抗TIPE2多肽片段的多克隆抗体，并用免疫组织化学的方法检测其特异性；通过免疫组织化学的方法检测正常人组织芯片中多种组织TIPE2的表达；收集山东大学齐鲁医院内镜室溃疡性结肠炎患者活检组织、普外科手术组织及正常人活检组织，通过免疫组织化学的方法对TIPE2的表达情况进行检测；同时，应用免疫组织化学的方法检测人多种正常组织中TIPE2的表达情况。 结果： 一、TIPE2在鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达及其与细胞因子的关系 1．鼠动脉粥样硬化斑块模型的建立 8周龄ApoE-/-小鼠血管壁无斑块的形成，但高脂喂养至16周龄后，主动脉根部已形成以纤维为主的早期粥样硬化斑块，24周龄时形成以脂质成分居多的晚期斑块，同周龄野生型C57小鼠血管壁内均未见斑块形成。 2．TIPE2在鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达 取不同周龄ApoE-/-及C57小鼠的主动脉根部，用半定量RT-PCR的方法检测TIPE2和细胞因子的表达，结果显示TIPE2在ApoE-/-小鼠无斑块期（8周）、斑块早期（16周）及斑块中晚期（24周）主动脉根部的表达均明显高于同龄野生型C57小鼠。 3．TIPE2与细胞因子表达的关系 在无斑块期IL-12p40、TGF-β及TNF-α表达较C57小鼠已明显升高（P<0．05）；在斑块早期时，TGF-β及TNF-α表达仍然高于对照组（P<0．05）；进一步分析发现TIPE2的表达和TNF-α呈正相关，相关系数为0．757（P=0．007），但与IL-6、IL-12p40和TGF-β表达无明显相关性。 二、TIPE2在人脐静脉内皮细胞的表达及影响因素 1．人脐静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定结果 应用0．125％胰酶+0．01％EDTA消化液将脐静脉内皮细胞分离后，在M199+20％ FBS+贝复济的完全培养基中培养至4-10代用于实验研究。在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形或卵圆形，胞质丰富，核呈圆形，鹅卵石状镶嵌排列。八因子相关抗原免疫细胞化学染色可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆内可见棕黄色颗粒，核周密集，证实培养的细胞为内皮细胞 2．TIPE2在人脐静脉内皮细胞的表达 培养并扩增人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后，以培养的人平滑肌细胞系（CRL1999）作为阴性对照，以人结肠组织作为阳性对照，用RT-PCR的方法检测TIPE2的表达，结果发现TIPE2在人平滑肌细胞系不表达，但在结肠中表达量较高，而在人脐静脉内皮细胞中呈低表达；进一步测序结果证实扩增的PCR产物是TIPE2；免疫细胞化学检测发现，培养的内皮细胞中TIPE2蛋白呈弥散状分布于胞浆中，为弱阳性；另外，TIPE2也表达在人正常主动脉中的内皮细胞，为弱阳性。 3．影响TIPE2表达的因素 为了分析影响TIPE2表达的因素，我们根据第一部分结果的提示，首先用不同浓度的TNF-α（对照组、5ng、10ng、20ng和40ng）刺激HUVEC，发现TNF-α能上调TIPE2的表达；其次，oxLDL作为一种自身抗原在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用，可诱导内皮细胞的凋亡，因此，我们在体外给予培养的内皮细胞不同浓度oxLDL（对照组、12．5μg、25μg、50μg、75μg和100μg组）刺激，结果证实，在oxLDL浓度为12．5μg和25μg时，同对照组相比，TIPE2的表达明显上调，但随着oxLDL浓度升高，TIPE2的表达逐渐下降；同时，TNF-α和oxLDL均能上调内皮中黏附分子（ICAM-1和VCAM-1）的表达。 三、兔抗人TIPE2多克隆抗体的制备和应用 1．兔抗人TIPE2多克隆抗体多肽片段的选择及其抗体制备 我们根据人TIPE2晶体结构的及TIPE家族同源性分析，并结合抗体设计筛查软件，确定制备抗体的多肽片段为：RSVAHLFID，经由武汉博士德生物工程有限公司合成兔抗人TIPE2多肽抗体，经检测其抗体含量为200μg/ml，具有较强的特异性，仅与TIPE2反应，而与TIPE家族其它成员无反应。 2．人多种正常组织中TIPE2表达的检测 采用免疫组织化学的方法对组织芯片中十几种正常组织器官中TIPE2的表达进行了检测。TIPE2不仅表达于免疫细胞，也表达于非免疫细胞。 3．溃疡性结肠炎患者病变局部TIPE2表达检测 溃疡性结肠炎是以肠粘膜的的慢性炎症的病变，免疫平衡失常被认为是其发病机制的中心环节，而TIPE2是一种新型的免疫反应调节蛋白，为了探索TIPE2与该疾病的关系，我们对比研究了正常结肠和溃疡性结肠炎结肠病变局部的TIPE2表达情况，结果显示TIPE2在正常结肠腺体上皮细胞的胞浆中呈弱阳性；而在溃疡性结肠炎患者结肠腺体呈中度阳性表达，主要表达于浅层上皮细胞胞浆中，而深层上皮细胞不表达TIPE2，在粘膜下固有层间质中淋巴细胞及浆细胞中也可见TIPE2呈强阳性的表达。提示TIPE2可能参入了溃疡性结肠炎的发生。 结论： 1．TIPE2在动脉粥样硬化斑块易感小鼠主动脉的表达高于正常野生型小鼠，且表达水平与TNF-α呈正比。 2．人TIPE2在血管内皮细胞弱表达，然而TNF-α、oxLDL和内皮细胞凋亡均能上调TIPE2的表达。 3．设计制备了兔抗大TIPE2的多克隆抗体，发现人TIPE2与小鼠的不同，不仅高表达于免疫细胞而且在非免疫细胞也有表达 4．溃疡性结肠炎时，结肠粘膜上皮细胞中TIPE2的表达升高 创新性和意义 1．TIPE2是新发现的基因，与疾病的关系尚不清楚。本研究首先发现鼠TIPE2在动脉粥样硬化斑块易感小鼠主动脉的表达高于正常野生型小鼠，且表达水平与TNF-α呈正比；另外，我们发现人TIPE2在血管内皮细胞也表达，TNF-α、oxLDL和凋亡均能上调TIPE2的表达，为研究TIPE2与动脉粥样硬化的关系提供了重要的线索。 2．目前关于TIPE2功能及特性的研究多来自小鼠，人TIPE2的特性尚不清楚。本研究首次发现人TIPE2与小鼠的不同，不仅高表达于免疫细胞而且在非免疫细胞也有表达；另外，我们发现溃疡性结肠炎时，结肠粘膜上皮细胞中TIPE2的表达升高，为进一步研究人TIPE2的功能和与疾病关系奠定了基础。 3．首先设计制备了人TIPE2的多克隆抗体，为以后TIPE2的研究提供了重要的研究手段。 局限性： 1．TIPE2是新发现的基因，由于没有特异性抗体，初期的研究受到很大的限制。 2．由于自行设计制备的抗体获得较晚，尽管已利用制备的抗体做了一些工作，但尚较肤浅，有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

前 言

材料和方法

结 果

一、TIPE2在鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达及其与细胞因子的关系

1.ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型的病理检测结果

2.TIPE2在动脉粥样硬化斑块形成中的表达

3.细胞因子在动脉粥样硬化斑块形成中的表达

4.TIPE2与细胞因子表达的关系

二、TIPE2在人脐静脉内皮细胞中的表达及其影响因素

1.人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定

2.TIPE2在人脐静脉内皮细胞的表达

3.影响人脐静脉内皮细胞中TIPE2表达的因素

三、兔抗人TIPE2多克隆抗体的制备和应用

1.兔抗人TIPE2多克隆抗体多肽片段的选择及其抗体制备

2.人多种正常组织中TIPE2表达的检测

3.溃疡性结肠炎患者病变局部TIPE2表达的检测

讨 论

结论与创新性和意义

附 图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录及获得的荣誉