纤维堆囊菌纤维素酶基因的生物信息学分析、异源表达及性质研究

摘要

纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）是降解纤维素活力较强的菌群，其纤维素酶活力严重依赖于菌体和底物的相互接触。堆囊菌纤维素酶在细胞上的组织形式，一直是研究者感兴趣的内容。另外，本实验室前期研究发现，纤维堆囊菌So0157-2菌株可在碱性条件下（pH>10）生长并降解纤维素。这种发现使本研究推测，纤维堆囊菌So0157-2菌株中，有耐碱性纤维素酶的存在，这为研究耐碱性纤维素酶，提供了良好的研究素材。 本研究利用word文档，Clustal和DNAman等生物信息学软件，针对纤维堆囊菌So0157-2菌株基因组测序获得的5202个重叠群（contigs），创建了一种新颖高效的氨基酸探针虚拟杂交的生物信息学方法，实现从庞大的基因组序列中快速筛选到纤维素酶基因的目的，设计了16组氨基酸序列虚拟探针，共搜索获得26个纤维素降解相关酶类的基因。 经过对纤维堆囊菌So0157-2菌株基因组测序信息的全基因组BLAST比对，全面地分析了纤维堆囊菌中纤维素降解相关酶的种类、数量。完成So ce56基因组注释信息的整理总结，分析纤维素酶在堆囊菌基因组上的分布方式等特征，进一步比较了堆囊菌纤维素酶基因和采取不同纤维素降解策略微生物的纤维素酶基因构成的差异，为进一步阐释堆囊菌纤维素降解特性奠定基础。 在序列分析的基础上，以So0157-2基因组contig00338、02247、01523中的纤维素降解相关酶基因为研究对象，构建了6个表达载体，通过表达条件的优化，实现了一个内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的活性表达。这些工作为堆囊菌纤维素酶的异源活性表达积累了经验。解决了在原始菌株中无法获得单组分酶蛋白的困难，为酶蛋白的生化特性分析和抗体制备提供高质量的材料。集中研究该内切葡聚糖酶，测定该酶的反应最适pH为7．3-7．6，最适温度为50℃，酶的比活力为1．662IU/mg，并完成酶热稳定性的测定，证明该酶在50度以下是基本稳定的。 为研究堆囊菌纤维素酶的构成和组织形式，使用ZAP表达载体构建了So9733-1基因组表达文库，文库含4万个克隆子，插入片段大小平均值3．98kb，覆盖度P=0．999982。该成果为活性筛选和序列筛选So9733-1中的纤维素酶基因奠定基础。对构建的So9733-1基因组表达文库开展了活性筛选，结果未获阳性克隆。表明进一步的序列筛选和PCR扩增方法将是获得So9733-1菌株纤维素酶基因的有效途径。 另外，在多种环境土样中分离出17株粘细菌菌株，扩展了粘细菌生存环境的认识，为分析不同环境的粘细菌纤维素酶种类与组成的多样性，更广泛研究不同粘细菌纤维素降解行为间的差异，提供了更多研究材料。 除以上的理论研究意义外，该研究还有一定的潜在应用价值。纤维素酶基因的克隆、异源活性表达和生化特性分析可能为酶蛋白的应用奠定基础，尤其是堆囊菌So0157-2菌株的耐碱性纤维素酶种类，有可能在造纸和纺织等领域获得应用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1纤维素酶的研究意义

1.1.1 纤维素的概况与结构

1.1.2 纤维素酶种类与分布

1.1.3 纤维素酶基因家族的概述

1.1.4 纤维素酶应用

1.2粘细菌的概况

1.2.1 粘细菌简介

1.2.2 粘细菌主要特性

1.2.3 粘细菌的分类

1.2.4 纤维堆囊菌介绍

1.3粘细菌生境及分离纯化

1.3.1 粘细菌生境

1.3.2 粘细菌分离纯化的现状与技术难点

1.4粘细菌纤维素酶的研究背景

1.4.1 微生物纤维素降解的三种策略

1.4.2 纤维小体的概述

1.4.3 纤维堆囊菌在滤纸上的形态学特征和纤维素降解特性

1.4.4 碱性纤维素酶的应用价值与研究现状

1.4.5 纤维堆囊菌耐碱性纤维素降解能力的发现

1.5 基因获取的主要策略与基因组表达文库的概况

1.5.1基因获取的主要策略

1.5.2基因组表达文库的概况

1.6本文工作开展方向与意义

1.6.1纤维堆囊菌基因组信息中的纤维素酶基因分析

1.6.2 So0157-2内切葡聚糖酶基因的克隆，表达与性质研究

1.6.3 纤维堆囊菌So9733-1基因组表达文库的构建与筛选

1.6.4粘细菌菌株的分离纯化

第二章纤维堆囊菌基因组中纤维素酶基因的生物信息学分析

2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1纤维堆囊菌So0157-2菌株基因组中纤维素酶基因信息分析

2.2.2 So ce 56菌株基因组中纤维素酶基因信息分析

2.2.3 部分目标序列的PCR检验

2.2.4基因组测序信息分析的结果讨论

2.3本章小结

第三章纤维堆囊菌内切葡聚糖酶基因的异源表达

3.1材料方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1 目的基因的选择与分析

3.2.2 So0157—2菌株内切葡聚糖酶基因的扩增与载体构建

3.2.3纤维堆囊菌So0157—2菌株内切葡聚糖酶异源表达

3.2.4 蛋白过柱纯化及透析除盐

3.2.5 内切葡聚糖酶的酶学性质分析

3.3本章小结

第四章So9733-1基因组表达文库的构建与活性筛选

4.1引言

4.2基因组表达文库构建的实验材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3实验结果与讨论

4.3.1获取基因组DNA

4.3.2酶切连接

4.3.3体外包装

4.3.4文库扩增

4.3.5 随机挑取噬菌斑，测定插入片段大小，测算文库覆盖度

4.3.6进行刚果红染色筛选

4.4本章小结

第五章粘细菌分离纯化

5.1粘细菌分离纯化与纤维素酶研究关系密切

5.2粘细菌分离纯化的实验材料与方法

5.2.1实验材料与试剂

5.2.2实验方法

5.3实验结果与讨论

5.3.1所获得的粘细菌菌株与照片

5.3.2所获菌株的PCR鉴定

5.3.3所获菌株的特点与结果讨论

5.4本章小结

论文总结与展望

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文