固相萃取高效液相色谱检测人血浆游离3-硝基酪氨酸方法与应用研究

摘要

目的：近年来研究表明，3—硝基酪氨酸是生物体内固有的一种含量极少的氨基酸，在正常人血浆中的含量水平通常大约为1 nmol/L。在氧化应激增强状况下，体内的一氧化氮自由基等活性氮族产生增加，通过自由基反应，能硝化体液中游离的酪氨酸或蛋白内的酪氨酸残基，使3—硝基酪氨酸含量增加，从而损害正常氨基酸和蛋白质的化学结构和生物学功能，引发病理改变。有研究表明，这一反应在超过40种疾病的发病过程中都有不同程度发生，因而检测生物体内活性氮族等活性物质参与的氧化应激的程度对探索疾病的发病机制有重要的意义。但活性氮族在体内非常不稳定，半衰期十分短暂，直接测定极其困难，而其特异性硝化酪氨酸的产物3—硝基酪氨酸则十分稳定，因而，目前对于人体内活性氮族生理及病理意义的认识主要是依据体液及组织中3—硝基酪氨酸含量的测定，3—硝基酪氨酸已被作为标示生物体内活性氮族等物质介导损伤的指示物。本研究拟建立一种灵敏、准确、重现性好的测定人血浆中游离3—硝基酪氨酸浓度的固相萃取—高效液相色谱—荧光检测法，并将方法应用于正常人、Ⅱ型糖尿病患者、慢性乙型肝炎患者血浆中游离3—硝基酪氨酸含量的测定，以期为研究活性氮族在Ⅱ型糖尿病、慢性乙型肝炎等疾病发生过程中的作用提供灵敏可靠的检验方法。 方法： 1．色谱条件：采用固相萃取—高效液相色谱—荧光检测法；岛津LC—10ATvp高效液相色谱仪，配SCL—10Avp控制器、LC—10ATvp二元泵、RF—10AXL荧光检测器、HT—230A柱温箱及20μL进样环；色谱柱：Nova—Pak C18（3．9×150 mm，4μm）；保护柱：迪马SecurityGuardTM C18（4×3．0 mm）；柱温：35℃；流动相：乙腈—0．02mol/L磷酸盐缓冲液；流速：1．0 mL/min；荧光检测器：λex=470 nm，λem=530nm；进样量：20μL；固相萃取柱：Waters Sep—Pak C18（100 mg，1 mL）； 2．主要试剂：所用溶液或试剂均为色谱纯或分析纯；色谱纯乙腈购买自美国J．T．Baker公司；硼酸、四硼酸钾、三氟乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等均为分析纯，购买自上海国药集团化学试剂有限公司；超纯水由Milli—Q超纯水系统制备；3—硝基酪氨酸标准品和作为内标的α—甲基酪氨酸标准品购买自美国Sigma公司；荧光剂4—氟—7—硝基—2，1，3—苯并氧杂恶二唑购买自东京化成工业株式会社；人空白新鲜血浆由山东血液中心提供； 3．血浆处理方法：将血浆在离心管中经合适的沉淀方法沉淀蛋白，离心后弃去沉淀，取出全部上清液，用氮气吹干，对固相萃取步骤和荧光衍生化反应步骤的先后次序进行摸索； 4．方法优化：从固相萃取小柱活化程序、淋洗液和洗脱液的选择等方面对固相萃取步骤进行优化；从荧光反应的温度和时间、缓冲液、乙腈浓度及NBD—F浓度的选择等方面对衍生化条件进行优化；从色谱柱的选择、流动相中的有机相的选择、有机相与水相的比例以及水相中三氟乙酸加入量的选择等方面对色谱条件进行优化； 5．方法考察：采用外标法和内标法定量。分别以3—硝基酪氨酸峰面积或3—硝基酪氨酸峰面积与内标峰面积比值对加标浓度绘制工作曲线，计算检出限，对高、中、低三个浓度的空白血浆进行加标回收率和精密度实验，计算绝对回收率和相对回收率，日内精密度和日间精密度，并考察3—硝基酪氨酸荧光衍生物和3—硝基酪氨酸的稳定性； 6．方法应用：将所建立的方法应用于健康志愿者、Ⅱ型糖尿病患者及慢性乙型肝炎患者血浆，分别测定其3—硝基酪氨酸浓度，并对测定结果进行t检验，通过统计分析结果证实活性氮族在Ⅱ型糖尿病及慢性乙型肝炎发病中对氨基酸及蛋白质的损伤作用。 结果： 1．在样品前处理步骤，沉淀血浆蛋白的有机溶剂选择为乙腈，血浆的使用量为500μL，乙腈的体积为1mL。固相萃取选择在衍生化反应之前进行。于500μL血浆中加入1 mL乙腈，涡旋混匀、离心后弃去沉淀，取出全部上清液，用氮气吹干，残渣先经固相萃取步骤净化，洗脱液再吹干，然后进行荧光衍生化反应。 2．衍生化反应在暗处进行，反应温度选择为60℃，反应时间为2 min，缓冲液为0．05 mol/L硼酸盐缓冲液（pH9．5），乙腈浓度为40%，荧光剂4．氟—7—硝基—2，1，3—苯并氧杂恶二唑浓度为4 mmol/L； 3．在色谱条件中，流动相选择为乙腈—0．02 mol/L磷酸盐缓冲液（缓冲液中加入500μL/L三氟乙酸，pH3．0）（36：64，V/V）；流速1．0 mL/min；柱温35℃；进样量为20μL； 4．外标法定量时工作曲线在0．50～50．0 nmol/L线性范围内线性良好，r=0．9999；在血浆中检出限为0．25 nmol/L（S/N=5）；样品加标绝对回收率为89．3%～91．9%，相对回收率为99．2%～107．9%；日内相对标准偏差为1．5%～4．8%，日间相对标准偏差为2．8%～9．2%；测定正常人血浆中3—硝基酪氨酸平均浓度为1．18nmol/L（SD=0．43 nmol/L，n=21），Ⅱ型糖尿病病人血浆中3—硝基酪氨酸平均浓度为3．63 nmol/L（SD=1．04 nmol/L，n=23）； 5．内标法定量时工作曲线在0．50～50．0 nmol/L线性范围内线性良好，r=0．9990；在血浆中检出限为0．25 nmol/L（S/N=5）；样品加标绝对回收率为87．7～91．5%，相对回收率为96．9%～110．0%；日内相对标准偏差为2．6%～6．4%，日间相对标准偏差为3．1%～7．2%；测定正常人血浆中3—NT平均浓度为1．19 nmol/L（SD=0．41 nmol/L，n=22），慢性乙型肝炎病人血浆中3—NT平均浓度为3．20 nmol/L（SD=0．51 nmol/L，n=20）。 结论： 1．目前对于人血浆中痕量3—硝基酪氨酸的检测，必须依赖灵敏度极高的荧光法或色谱—质谱联用法，才能获得准确可靠的结果。而色谱—质谱联用技术的仪器和运行成本较高，一般的分析化学实验室不易配备并进行大样本量的测定研究。本方法利用成本相对较低的高效液相色谱仪和荧光检测器，定量检出人血浆中痕量水平的3—硝基酪氨酸，具有灵敏度、准确度高，重现性好的优点，适用于临床研究中大样本量的测定和调查研究。 2．经t检验表明，Ⅱ型糖尿病和慢性乙型肝炎患者血浆中3—硝基酪氨酸含量与正常人血浆中3—硝基酪氨酸含量之间的差异具有统计学意义（P<0．01），提示在Ⅱ型糖尿病和慢性乙型肝炎病程中存在活性氮族所导致的氨基酸及蛋白损伤。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前 言

1仪器与试剂

2方法

3结果与讨论

4结论

参考文献

附综述 色谱及色-质联用技术测定生物样品中3-硝基酪氨酸研究进展

致谢

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