超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii遗传转化系统的构建

摘要

遗传转化系统（包括蛋白质表达系统和基因敲除系统），是研究基因或基因产物功能的一个极为重要的工具。对于细菌及真核生物，遗传转化系统已非常成熟。然而，就古菌而言，遗传转化系统发展相对滞后，主要原因是选择标记的缺乏。近二十年来，在超嗜热古菌Sulfolobus中发现了为数不少病毒、质粒等染色体外遗传元件，但以这些遗传元件构建遗传系统的进展远远滞后于产甲烷菌及嗜盐菌中相应的研究。在过去的十年中，在Sulfolobus中先后报道了数个遗传系统，但这些遗传系统往往难以被其它实验室重复。直到最近，研究者所构建的遗传系统才在不同实验室得到应用。 在Sulfolobus属中，目前有三个种已完成全基因组序列的测定并公开发表，即S．solfataricus、S．tokodaii和S．acidocaldarius。对于S．solfataricus和S．acidocaldarius，遗传转化系统已成功建立并极大地促进了基因功能的研究。然而，迄今为止，对于S．tokodaii，尚未有任何遗传转化系统的报道。因此，在S．tokodaii中开展遗传转化系统方面的探索和研究具有重要的理论意义和应用价值。 编码乳清苷酸焦磷酸化酶（pyrE）和乳清苷酸脱羧酶（pyrF）的基因广泛用作古菌的选择标记。本研究首先以pyrEF为选择标记，构建了S．tokodaiiβ-半乳糖苷酶基因lacS的敲除载体p5EF3。在遗传学研究中，通常采用lacS作为报告基因来检测表达载体的蛋白质表达水平或分析启动子的活性，因而可以将获得的lacS敲除菌株作为新的宿主菌用于报告基因系统中，从而避免内源性lacS的表达对穿梭载体中报告基因表达的干扰。 在古菌的细胞膜磷脂生物合成过程中，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶（HMG-CoA还原酶）起着关键的作用。辛伐他汀（simvastatin）是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，从而抑制细胞的生长；HMG-CoA还原酶的过量表达能消除辛伐他汀的竞争性抑制作用。辛伐他汀及其同系物莫维诺林（mevinolin）作为抗生素，已被成功应用于古菌的遗传学研究中，但在Sulfolobus遗传系统中迄今未见报道。基于上述分析，本研究检测了不同浓度的辛伐他汀对野生型S．tokodaii生长的影响情况，结果显示15μM辛伐他汀在168小时内能完全抑制野生型S。tokodaii细胞的生长，表明辛伐他汀可以作为抗生素用于S．tokodaii遗传转化系统的构建。接着，本研究利用重叠延伸PCR技术，将S．solfataricus来源的谷氨酸脱氢酶启动子序列与S．tokodaii来源的HMG-CoA还原酶基因融合，构建成一个HMG-CoA还原酶过表达cassette，然后以该HMG-CoA还原酶过表达cassette为筛选标记基因，构建了针对S．tokodaii pyrE的基因敲除载体 p5PH3。将载体p5PH3电转化野生型S．tokodaii，目前已获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，分子水平上的鉴定正在进行中。此外，为检测S．tokodaii来源的HMG-CoA还原酶是否具有预期的酶活性，本研究克隆了该古菌中的HMG-CoA还原酶基因，并在大肠杆菌中表达和纯化了HMG-CoA还原酶，并测到了HMGR的酶活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1古菌及超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的概述

1.1.1生物分类

1.1.2古菌的分类

1.1.3超嗜热古菌概述

1.1.4超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7概述

1.2古菌的遗传转化系统概述

1.2.1转化方法

1.2.2限制／修饰系统

1.2.3选择标记

1.2.4古菌穿梭载体及其应用

1.2.5细菌和古菌的基因敲除系统

1.3本试验的立题依据和基本思路

1.3.1立题依据

1.3.2基本思路

第二章 Sulfolobus tokodaii lacS及pyrE基因敲除载体的构建

2.1引言

2.2实验材料、试剂与实验仪器

2.3实验方法与步骤

2.3.1基因克隆方法及步骤

2.3.2 S.tokodaii lacS基因敲除载体p5EF3的构建

2.3.3 S.tokodaii pyrE基因敲除载体p5PH3的构建

2.4结果与讨论

2.4.1构建S.tokodaii lacS基因敲除载体p5EF3

2.4.2构建S. tokodaii pyrE基因敲除载体p5PH3

第三章 Sulfolobus tokodaii 3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆、表达及蛋白的纯化与酶活测定

3.1引言

3.2实验材料、试剂与仪器

3.3实验方法与步骤

3.3.1 StoHMGR基因克隆

3.3.2 stortMGR蛋白表达及纯化

3.3.3 StoHMGR酶活测定

3.4结果

3.4.1 StoHMGR基因的克隆

3.4.2 StoHMGR蛋白表达与纯化

3.4.3 StoHMGR酶活测定

3.5讨论

第四章 Sulfolobus tokodaii的电转化及突变体筛选

4.1引言

4.2实验材料、试剂和仪器

4.3实验方法与步骤

4.3.1不同辛伐他汀浓度对S.tokodaii生长的影响

4.3.2基因敲除载体的甲基化处理

4.3.3电转化S.tokodaii感受态细胞

4.4结果与讨论

4.4.1不同辛伐他汀浓度对S. tokodaii生长的影响

4.4.2载体的甲基化处理

4.4.3 S.tokodaii尿嘧啶营养缺陷型菌株的获得

4.5小结

第五章总结与展望

5.1总结

5.2展望

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章