蛋白酶体抑制剂对自然杀伤细胞活性和功能影响的研究

摘要

泛素-蛋白酶体（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶体主要由20S催化颗粒和19S调节颗粒两部分组成，其活性状态对维持细胞的正常功能起重要作用。蛋白酶体抑制剂可通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞功能，尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib，velcade）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂，目前已被较广泛地应用于多种恶性肿瘤特别是多发性骨髓瘤的治疗。除了直接诱导肿瘤细胞凋亡外，硼替佐米尚可提高肿瘤细胞对自然杀伤（natural killer，NK）细胞杀伤的敏感性。然而，近年来研究发现硼替佐米对免疫细胞如T细胞和树突细胞有一定的毒性作用，如诱导活化的T细胞凋亡，抑制树突细胞活化T细胞的功能等。NK细胞是先天免疫细胞，在抗感染和抗肿瘤免疫中起着致关重要的作用。目前，有关硼替佐米对NK细胞功能调节作用的研究甚少。 目的：研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对正常人外周血NK细胞活性和功能的影响，探讨硼替佐米诱导NK细胞凋亡机制；观察联合应用硼替佐米与IL-12对多发性骨髓瘤SCID鼠皮下移植瘤生长及体内NK细胞杀伤活性的影响，研究IL-12与硼替佐米协同抗肿瘤作用以及IL-12抵抗硼替佐米对NK细胞的毒性作用。 方法: 1.体外研究硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响 1.1硼替佐米对人外周血淋巴细胞或LAK细胞活性的影响：采用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞，去除贴壁细胞后获取悬浮细胞即外周血淋巴细胞（PBLs）。体外应用白介素-2（IL-2）诱导PBLs72h产生淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞。将PBLs、LAK细胞进行体外培养，给予不同浓度的硼替佐米处理12、24、48h，采用AnnexinⅤ（AV）和propidium iodide（PI）双标进行流式细胞术检测细胞凋亡情况。 1.2硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响：采用NK细胞阴性选择试剂盒分离纯化正常人NK细胞，流式细胞术检测NK纯度，将NK细胞进行体外培养，给予不同浓度的硼替佐米处理12、24h，或联合应用GSH（氧自由基清除剂）或zVAD（全Caspase抑制剂）预处理，AV和PI双标进行流式细胞术检测细胞凋亡；荧光测定半胱天冬酶caspase-3活性的变化；Mitotracker Red荧光染色法测定线粒体膜电位的改变；细胞内染色法检测穿孔素的表达；细胞表面染色检测NK细胞膜活化性受体的表达；分别以K562细胞和P815细胞作为靶细胞采用标准的4h51Cr释放试验检测NK细胞的细胞毒作用或杀伤功能。 2.硼替佐米对骨髓瘤小鼠自然杀伤细胞活性和功能的影响 2.1建立SCID鼠多发性骨髓瘤皮下移植瘤模型：对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞数至1×108/ml，取0.1 ml含107个细胞接种于5-6周龄雌性SCID鼠前肢处背部皮下。14d后实体瘤长至直径大于0.5cm时进行药物干预。 2.2荷瘤小鼠体内注射NS、硼替佐米和/或IL-12抑瘤效果观察、NK细胞数变化及脾细胞杀伤功能SCID鼠皮下成瘤后随机分成NS组、IL-12组（0.4ug/只）、硼替佐米组（0.75mg/kg）和硼替佐米+IL-12序贯治疗组，分别给予腹腔注射IL-12，尾静脉注射硼替佐米和NS，观察荷瘤小鼠瘤体的生长抑制情况；干预前后取外周血做血常规及流式检测NK细胞比例，末期取脾细胞悬液做LDH释放实验检测NK细胞的杀伤功能。 结论: 1.硼替佐米主要过ROS依赖及非依赖机制造成线粒体膜电位的耗散，导致人PBLs、LAK细胞、NK细胞凋亡。 2.硼替佐米可以降低静止期NK细胞表面NKp46的表达，并抑制NKp46活化途径所介导的NK细胞杀伤功能。 3.硼替佐米可减少骨髓瘤小鼠体内NK细胞数，影响其杀伤功能，联合IL-12治疗有协同抗肿瘤作用，同时可部分解救硼替佐米对NK细胞的毒性作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略语

声明

前言

第一部分蛋白酶体抑制剂对人外周血自然杀伤细胞活性和功能影响的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分蛋白酶体抑制剂对骨髓瘤小鼠体内自然杀伤细胞活性和功能影响的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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