溶菌酶滴眼液的研制及对兔细菌性角膜炎模型的作用研究

摘要

临床常见感染性眼病，如眼结膜炎和角膜炎多以细菌性感染为主，在发展中国家，细菌性角膜炎是致盲的第一位原因。大量的临床病原学分析表明，革兰氏阳性球菌，如表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和微球菌等是主要致病菌；革兰氏阴性杆菌，如铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等次之。革兰氏阳性球菌感染的比例有逐年增高的趋势，革兰氏阴性杆菌感染呈下降趋势。目前，细菌性眼病治疗主要以抗生素眼药水最为常用，但容易产生耐药性。随着抗生素的大量应用，耐药菌株也不断增加。并且抗生素眼药水因其副作用不宜长期使用。因此，研制新的用于治疗细菌性眼病的眼药水就成为了研究的热点。 溶菌酶是一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，它具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒和抗肿瘤等。溶菌酶抗菌作用机制为其能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰葡糖胺的4位碳原子间的β-1，4糖苷键。溶菌酶对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌和耐辐射微球菌均有良好的分解作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度的溶解作用。溶菌酶抗病毒机制为因溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。另外，溶菌酶具有生物相容性好、不易产生耐药性、对组织无刺激和无毒性等优点。目前，研究最多也是了解最清楚的溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶，它化学性质非常稳定，对热也极为稳定，在pH值1.2～11.3范围内剧烈变化时其结构几乎不变，它还具有和人及哺乳动物溶菌酶相同的作用机制。因此，本研究以溶菌酶的酶活性为主要指标，对将鸡蛋清溶菌酶制成滴眼液的可能添加的辅料进行了筛选，并对处方进行了优化；通过抑菌实验确定了鸡蛋清溶菌酶的作用浓度，最终确定处方工艺，且对最终处方进行了稳定性考察，利用兔角膜炎模型对溶菌酶效果进行了验证。本课题的研究内容主要与结果有以下几个方面。 1、蛋清溶菌酶酶学性质的研究 通过SDS-PAGE和测定溶菌酶酶活等手段对所用蛋清溶菌酶酶学性质进行了研究。结果表明，所使用蛋清溶菌酶的相对分子质量（Mr）约为14 kD；溶菌酶在pH值6～6.5活性最强，pH值5～7范围内比较稳定，pH值大于7活性急剧下降；在25～65℃温度范围内，随温度升高，酶活性增强，温度升高至65℃后，随温度升高，酶活性下降，超过75℃，活性急速下降。 2、眼用制剂常用成分和辅料与蛋清溶菌酶配伍性研究 研究了眼用制剂常用成分和辅料对蛋清溶菌酶活性的影响。结果表明，对溶菌酶活性有抑制的有：Ca2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、吐温-20、吐温-80及甘油、0.3％以上浓度EDTA-2Na、浓度大于5％乙醇、浓度大于0.25％牛磺酸、浓度大于0.5％ VB6和浓度大于0.05％硼砂；对溶菌酶活性没有明显影响的是：丙二醇、冰片和门冬氨酸；对溶菌酶活性有增强作用的是：Na+、Mn2+、K+、Mg2+、0.0005％～0.3％EDTA-2Na、0.05％～2％硼酸、0.012％～0.04％薄荷脑、0.5％～10％甘氨酸、0.012％～0.04％尼泊金乙酯、0.05％～0.5％三氯叔丁醇和0.03％以下苯扎溴铵。 3、蛋清溶菌酶抑菌活性的实验研究 通过测定不同条件下蛋清溶菌酶抑菌活性，发现：溶菌酶浓度在2.5μg/mL以上对溶壁微球菌具有杀菌作用；1mg/mL以上对地衣芽孢杆菌具有杀菌作用；在1.8mg/mL以上对蜡样芽孢杆菌有较强抑制作用；在60μg/mL以上对枯草芽孢杆菌有杀菌作用；在大于0.01％EDTA-2Na存在下，在3.3mg/mL以上对金黄色葡萄球菌具有杀菌作用；在EDTA-2Na存在下3mg/mL浓度即对白色念珠菌有杀菌作用。研究还发现：EDTA-2Na存在下，7.5mg/mL浓度对铜绿假单胞菌没有明显作用；在4mg/mL浓度时对大肠杆菌抑菌作用仍然较弱。 4、溶菌酶滴眼液处方工艺研究 根据各处方稳定性实验的结果，确定以磷酸盐缓冲液体系为pH缓冲体系，添加抑菌剂、清凉剂、金属螯合剂、活性增强剂和渗透压调节剂等。最终处方如下：溶菌酶（主药），5g；磷酸氢二钠（缓冲液），7.86g；磷酸二氢钠（缓冲液），10.4g； EDTA-2Na（活性增强剂，金属螯合剂），0.5g；氯化钠（渗透压调节剂），3.4g；薄荷脑（清凉剂），0.25g；乙醇（助溶剂），5mL；苯扎溴铵（抑菌剂），0.2g；注射用水定容至1000mL。 5、溶菌酶滴眼液质量研究实验及质量标准的制定 据药典规定，经研究制定了溶菌酶滴眼液的质量标准草案。 6、溶菌酶滴眼液稳定性研究 依照本品质量标准草案，对本品稳定性进行了稳定性考察，考察项目主要包括外观性状、pH值测定、渗透压测定、可见异物检查、微生物限度检查和含量测定等。初步考察结果表明，溶菌酶滴眼液稳定性好。 7、溶菌酶滴眼液对兔细菌性角膜炎模型作用研究 研究表明，溶菌酶滴眼液能有效控制金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌所致角膜炎症，有效缓解症状，使角膜内细菌数显著减少。 8、溶菌酶滴眼液局部刺激性实验 研究表明，溶菌酶滴眼液对眼睛无刺激性。 本研究获得的成果和结论主要有： （1）研究了蛋清溶菌酶的酶学性质和抑菌活性，并通过研究眼用制剂常用辅料与蛋清溶菌酶的配伍性和不同处方的稳定性完成了溶菌酶滴眼液的处方筛选。 （2）根据药典规定，制定了溶菌酶滴眼液的质量标准草案，并以此为标准研究发现该滴眼液稳定性较好。 （3）研究表明，该溶菌酶滴眼液能有效控制金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌所致角膜炎症，有效缓解症状，使角膜内细菌数显著减少。 （4）研究表明，该溶菌酶滴眼液对眼睛无刺激性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

1外眼感染疾病眼用制剂的现状

1.1外眼感染疾病的研究进展

1.2外眼感染疾病的治疗药物与不足

2溶菌酶

2.1溶菌酶简介

2.2溶菌酶的作用及作用机制

2.3溶菌酶的应用研究

2.4溶菌酶的药用研究

3溶菌酶眼部治疗应用展望

4本研究拟解决的问题

第二章蛋清溶茵酶酶学性质的研究

1材料和仪器

1.1试剂与药品

1.2仪器

2试验方法

2.1溶菌酶原料相对分子质量(Mr)测定

2.2溶菌酶酶活性的测定方法

2.3蛋清溶菌酶最适作用pH的测定

2.4蛋清溶菌酶最适作用温度的测定

2.5溶菌酶pH值稳定性的试验

2.6溶菌酶温度稳定性的试验

3结果

3.1溶菌酶原料的Mr

3.2蛋清溶菌酶最适作用pH

3.3蛋清溶菌酶最适作用温度

3.4溶菌酶pH值稳定性的试验

3.5溶菌酶温度稳定性的试验

4讨论

5结论

第三章眼用制剂常用成分和辅料与蛋清溶菌酶配伍性研究

1材料

1.1试剂与药品

1.2仪器

2方法

2.1常见金属离子对溶菌酶活性的影响

2.2常用助溶剂对溶菌酶活性的影响

2.3不同浓度的EDTA-2Na对溶菌酶活性的影响

2.4不同浓度乙醇对酶活性的影响

2.5不同浓度丙二醇对酶活的影响试验

2.6不同浓度硼酸对酶活的影响试验

2.7硼砂对酶活的影响试验

2.8冰片浓度对酶活的影响试验

2.9薄荷脑浓度对酶活的影响试验

2.10维生素B6浓度对酶活的影响试验

2.11牛磺酸浓度对酶活的影响试验

2.12门冬氨酸浓度对酶活的影响试验

2.13甘氨酸浓度对酶活性的影响试验

2.14尼泊金乙酯浓度对酶活性的影响试验

2.15三氯叔丁醇浓度对酶活性的影响试验

2.16苯扎溴铵浓度对酶活的影响试验

3结果

3.1常见金属离子对溶菌酶活性的影响

3.2常见助溶剂对溶菌酶活性的影响

3.3不同浓度的EDTA-2Na对溶菌酶活性的影响

3.4乙醇浓度对酶活的影响

3.5丙二醇浓度对酶活的影响

3.6硼酸浓度对酶活的影响

3.7硼砂浓度对酶活的影响

3.8冰片浓度对酶活的影响

3.9薄荷脑浓度对酶活的影响

3.10维生素B6浓度对酶活的影响

3.11牛磺酸浓度对酶活的影响

3.12门冬氨酸浓度对酶活的影响

3.13甘氨酸浓度对酶活的影响

3.14尼泊金乙酯浓度对酶活的影响

3.15三氯叔丁醇浓度对酶活的影响

3.16苯扎溴铵浓度对酶活的影响

4讨论

4.1金属离子

4.2助溶剂

4.3 EDTA-2Na

4.4乙醇

4.5丙二醇

4.6硼酸

4.7硼砂

4.8冰片

4.9薄荷脑

4.10维生素B6

4.11牛磺酸

4.12门冬氨酸

4.13甘氨酸

4.14尼泊金乙酯

4.15三氯叔丁醇

4.16苯扎溴铵

5结论

第四章蛋清溶菌酶抑菌活性的试验研究

1材料

1.1菌种

1.2试剂

1.3培养基

1.4仪器与设备

2方法

2.1显微镜直接计数法

2.2平板菌落计数法

2.3溶菌酶对溶壁微球菌抑菌作用试验

2.4溶菌酶对大肠杆菌抑菌作用试验

2.5溶菌酶对地衣芽孢杆菌抑菌作用试验

2.6比浊法测定溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的抑菌作用试验

2.7溶菌酶对蜡样芽孢杆菌抑菌作用试验

2.8溶菌酶对枯草芽孢杆菌抑菌作用试验

2.9溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑菌作用试验

2.10 EDTA-2Na对溶菌酶抑制金黄色葡萄球菌作用的影响试验

2.11平板倾注法观察溶菌酶抑制金黄色葡萄球菌作用试验

2.12溶菌酶对白色念珠菌抑菌作用试验

2.13溶菌酶对铜绿假单胞菌的抑菌作用试验

2.15平板倾注法观察溶菌酶对铜绿假单胞菌作用试验

3结果

3.1溶菌酶对溶壁微球菌抑菌作用

3.2溶菌酶对大肠杆菌抑菌作用

3.3溶菌酶对地衣芽孢杆菌抑菌作用

3.4比浊法测定溶菌酶对溶壁微球菌、大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的抑菌作用

3.5溶菌酶对蜡样芽孢杆菌抑菌作用

3.6溶菌酶对枯草芽孢杆菌抑菌作用

3.5溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

3.6 EDTA-2Na对溶菌菌酶抑制金黄色葡萄球菌作用的影响

3.7平板倾注法观察溶菌酶抑制金黄色葡萄球菌作用结果

3.8溶菌酶对白色念珠菌作用

3.9液体培养法观察溶菌酶对铜绿假单胞菌的作用

3.10平板倾注法观察溶菌酶抑制铜绿假单胞菌作用

4结论

5结论

第五章溶菌酶滴眼液处方工艺研究

1材料与仪器

1.1试剂

1.2仪器

2方法与结果

2.1辅料选择

2.2基本处方研究

2.3清凉剂的确定

2.4最终处方的确定

2.5样品试制

第六章溶菌酶滴眼液质量研究及质量标准的制定

1材料与仪器

1.1试剂

1.2仪器

2研究内容

3结果

3.1检查项目

3.2含量测定

3.3拟定质量标准草案

4讨论

第七章溶菌酶滴眼液稳定性研究

1材料与仪器

1.1试剂

1.2仪器

2方法

3内容

4结果与结论

第八章溶菌酶滴眼液对兔细菌性角膜炎模型作用研究

1材料与仪器

1.1药品与试剂

1.2仪器

2实验动物

3研究内容及方法

3.1细菌性角膜炎模型建立

3.2分组及处理

3.3角膜炎评定指标

4结果

4.1角膜肉眼形态学观察

4.2角膜病理检查

4.3角膜细菌培养CFU计数

5讨论

6结论

第九章溶菌酶滴眼液局部刺激性试验

1药品与试剂

2实验动物

3研究内容及方法

4结果

5结论

总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文