RNAi抑制Bcl-2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性的体外实验研究

摘要

目的：体外研究凋亡抑制基因Bcl-2小干扰RNA（RNAi）转染肺腺癌A549细胞后对其凋亡的影响，探讨Bcl-2小干扰RNA与A549细胞放射敏感性的关系，将小干扰RNA技术与放射治疗进行有机结合，寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的新方法。 方法：1.构建Bcl-2基因的干扰质粒pBcl-2-siRNA，稳定转染人肺腺癌A549细胞，同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。应用Real time RT-PCR和Western blot的方法观察Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平表达上的变化，从而鉴定干扰质粒pBcl-2-siRNA的有效性。2.流式细胞术检测A549细胞凋亡率，量化凋亡结果，比较干扰质粒pBcl-2-siRNA组、无意义链组、空载体组和未转染组凋亡率的不同。并给予6Gy X线照射，再次比较以上四组细胞凋亡率的变化。3.克隆形成实验获得干扰质粒pBcl-2-siRNA组、无意义链组、空载体组和未转染组在各剂量下的细胞存活分数，利用统计软件完成细胞放射后存活曲线的拟和，证明干扰质粒pBcl-2-siRNA对A549细胞放射敏感性的增强效应。 结果：1.成功构建了Bcl-2 SiRNA质粒，转染A549细胞后，经筛选获得稳定转染细胞株A549/Bcl2-Ins，Real time RT-PCR显示Bcl-2 mRNA表达明显降低，Western blot表明Bcl-2蛋白表达明显降低。证明A549细胞的Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平被成功抑制。2.流式细胞术检测A549/Bcl2-Ins凋亡率[（10.11±0.92）％]明显高于对照组[（5.52±0.48）％]等，6Gy X线照射后凋亡率[（28.81±1.10）％]明显高于对照组[（19.88±0.88）％]等，及未照射组[（5.52±0.48）％]等。证明Bcl-2 SiRNA质粒增加了A549细胞的凋亡，并与放射线有协同作用。3.克隆形成实验结果发现A549/Bcl2-Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298，明显低于转染无意义序列的细胞株A549/ Bcl2-Neg（1.695和2.480）、转染空载体的细胞株A549/SD（1.706和2.227）和空白对照细胞A549（1.816和2.777）。A549/Bcl2-Ins较其他对照组放射增敏有显著差异（P<0.05）。 结论：1.本实验成功构建的Bcl-2 SiRNA质粒，能有效地抑制相应基因的表达。2.向A549细胞转染Bcl-2 SiRNA质粒能够显著增加细胞凋亡，并与放射线有协同作用。3.转染后A549细胞放射敏感性增加。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分Bcl-2 SiRNA转染肺腺癌A549细胞及其功能表达的检测

实验一Bcl-2 SiRNA的制备和肺腺癌A549细胞的转染

材料和方法

结果

附图

实验二Bcl-2 SiRNA功能表达的检测

材料和方法

结果

附图

第二部分Bcl-2 SiRNA成功转染后的促凋亡和放射增敏作用

实验一X线照射及流式细胞仪检测细胞凋亡率

材料和方法

结果

实验二克隆形成实验

材料和方法

结果

附图

第三部分讨论

第四部分 结论

参考文献

文献综述:肺癌基因治疗的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢