应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究

摘要

目的： 关节软骨主要是由软骨细胞及其周围的外基质组成的无血管组织。关节软骨损伤是骨科的较为常见的疾患，其损伤后自我修复能力很弱，至今软骨缺损的修复仍无理想的方法。创伤、骨软骨炎、骨性关节炎、髌骨软化等均可引起软骨以及软骨下骨的损伤和（或）缺损。软骨损伤的修复一直是骨关节外科的一个难题，目前对于轻度的软骨损伤主要以保守疗法为主，而晚期严重的软骨损伤可引起严重的膝关节疼痛，畸形等，通常采用人工关节置换术为主。本课题采用组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（bMSCs），用微团培养方法经过特定生长因子诱导生成软骨细胞和成骨细胞后，将软骨细胞、成骨细胞种植于三维多孔β—磷酸三钙（β—TCP）生物陶瓷支架材料上置于生物反应器中复合培养，构建骨软骨复合体，观察细胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情况，并模仿马赛克骨软骨移植术用塑型良好的骨软骨复合体修复动物软骨缺损，观察其修复情况，探讨以β—TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。 材料和方法： 1.取4—10月龄健康比格犬3只，无菌穿刺抽取髂骨骨髓6—7ml，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，进行原代、传代细胞培养。流式细胞仪鉴定。取第3代的bMSCs，根据滴加生长因子的不同，分为三组：Ⅰ组软骨细胞诱导组，滴加软骨细胞诱导液（组成：BMP—2200ng／ml，IGF—Ⅰ10ng／ml，转铁蛋白6．25ug/ml，地塞米松10—7M/L，维生素C50ug/ml）；Ⅱ组成骨细胞诱导组，滴加成骨细胞诱导液（组成：地塞米松100nmol／L，β—甘油磷酸钠10mmol/L，维生素C0．05mmol／L）；Ⅲ组空白对照组，未滴加任何诱导因子。三组中常规加入含10%胎牛血清的H—DMEM液，采用体外微团培养。倒置相差显微镜观察细胞生长状况，诱导培养14天后，软骨细胞诱导组行MTT法观察细胞增殖状况，细胞培养上清液检测糖胺聚糖的含量，免疫细胞化学检测诱导细胞Ⅱ型胶原的分泌，以观察bMSCs向软骨细胞分化的情况；成骨细胞诱导组行碱性磷酸酶染色和矿化结节染色以观察bMSCs向成骨细胞分化的情况。 2.取经过诱导培养14天的bMSCs，经检验诱导成软骨细胞和成骨细胞后，分别调整细胞浓度为5×106/ml，与β—磷酸三钙（β—TCP）复合培养1天，置入生物反应器中培养21天，进行复合组织的病理形态学观察；动物实验备用。β—磷酸三钙（β—TCP）及软骨细胞—成骨细胞—β—磷酸三钙支架复合体进行扫描电镜观察。以观察β—TCP支架材料的结构、孔隙率；观察软骨细胞、成骨细胞在β—磷酸三钙支架内黏附和生长增殖情况。 3.取10—12月龄健康比格犬9只，在实验犬的股骨滑车处钻直径4．5mm，深度4．5mm的骨软骨缺损，深达软骨下区。随机分为3组：A组，作为实验组，9只，左膝软骨缺损处深层植入软骨细胞—成骨细胞—β—磷酸三钙复合体；B组，作为阴性对照组，9只，左膝软骨缺损处植入软骨细胞—β—磷酸三钙复合体；C组，空白对照组，9只，左膝软骨缺损处植入空白β—磷酸三钙。分别于术后12、16周处死取材，进行大体和组织学观察。 结果: 1.细胞形态学改变倒置相差显微镜观察发现，原代细胞接种后1—3日可见少量细胞贴壁，呈短梭形。3日后可见细胞集落形成，7—8日广泛集落形成。12—14日细胞形成单层。传代细胞贴壁快，7—8日形成单层，细胞核大，胞浆内颗粒多。取P3代细胞进行微团诱导培养，加入细胞因子后，细胞生长加快，微团中央形成细胞团块，边缘呈漩涡状生长。 2.加入细胞因子BMP—2（Ⅰ组）的MTT吸光度值、培养上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ型胶原分泌均明显高于对照组（Ⅲ组）。Ⅱ型胶原免疫细胞化学阳性的bMSCs胞浆染色为黄色或棕黄色。碱性磷酸酶（ALP）染色显示成骨细胞胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀；矿化结节染色表明成骨细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节，常用茜素红法染色，染料品种的不同，矿化结节呈显不同的红色。 3.电镜观察：扫描电镜显示β—磷酸三钙（β—TCP）材料平均孔径为400～600μm，孔隙率为75%±10%，气孔沟通率达100%。复合材料显示软骨细胞、成骨细胞在β—磷酸三钙（β—TCP）支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以见到细胞分泌的基质和细胞伪足的铆固作用，表明支架材料具有良好的细胞亲和性。 4.动物实验结果 大体观察：术后16周，实验组缺损修复区组织与周围关节软骨相整合，软骨缺损区被光滑白色半透明的组织覆盖，与周围软骨组织外形无差异；阴性对照组缺损区修复组织与周围软骨部分整合在一起，光泽较差；空白对照组缺损处修复组织低凹，新生组织软，无光泽，与周围软骨组织区别明显。组织学观察：术后16周，实验组缺损区软骨厚度与正常软骨组织接近，细胞排列出现明显规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好。阴性对照组软骨细胞排列不规则，中央修复区大部分为纤维组织修复。空白对照组缺损区内主要为纤维组织。 结论： 1. bMSCs为软骨组织工程理想的种子细胞。取材方便，Percoll分离法分离可以获取大量骨髓间充质干细胞，体外培养能够保持其表形的稳定性，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞和成骨细胞。 2. BMP—2在促进bMSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有显著的作用，均明显高于对照组，是目前诱导bMSCs向软骨细胞方向分化的理想细胞因子。 3.三维培养方法是目前诱导bMSCs向软骨方向分化的最理想的培养方法。 4. β—磷酸三钙（β—TCP）支架是理想的软骨组织工程支架材料。具有良好的孔隙率和组织相容性，软骨细胞和成骨细胞在其中可以很好地黏附、扩展和增殖。 5. bMSCs经向软骨细胞、成骨细胞定向分化后复合β—磷酸三钙（β—TCP）支架材料，在体外构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。动物实验表明，该复合体修复的软骨缺损明显优于软骨细胞—β—磷酸三钙复合体修复的软骨缺损，与正常软骨组织形态接近。 6. 灌注型生物反应器使软骨和成骨细胞在三维载体内存活并增殖，提高细胞在载体内的复合效率。

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前言

实验一骨髓间充质干细胞的分离、培养和向软骨细胞、成骨细胞方向诱导、分化的实验研究

实验二应用生物反应器构建软骨细胞、成骨细胞复合β—磷酸三钙(β-TCP)的体外培养研究

实验三骨软骨复合组织修复关节软骨损伤的动物实验研究

讨 论

结 论

附 图

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的论文