NAD保护神经轴突抑制变性的实验研究

摘要

神经轴突变性（axonal degeneration）是神经源性疾病中常见的一种病理变化，常发生于神经损伤、神经中毒、神经退行性变及多发性硬化等多种疾病。轴突变性常出现于神经细胞死亡之前，是神经元死亡的先兆。在进行性的神经退变中，轴突变性可活化神经元死亡的上游机制，导致神经功能障碍。研究表明，抑制和延缓轴突变性是保护神经元存活、促进神经再生、重建神经功能的有效方法，将为神经损伤及神经退行性疾病提供新的治疗策略。 传统的观点认为，轴突变性是由于失去了神经元胞体的支持营养作用而引起的继发病变，是一种被动溃变，因此，长期以来一直认为轴突一旦损伤，就是不可逆的过程。近年来研究发现轴突变性并非以往认为的被动溃变，而是一个主动的毁损过程。尤其是轴突变性延缓鼠（wallerian degeneration slow mice．Wlds mice）的发现，更加佐证了轴突变性是由轴突内在的程序决定，是主动的毁损过程。该鼠是一种基因自然突变鼠，在神经轴突切断后，可保持2～3周不发生溃变，而正常鼠的轴突在切断后48h即发生变性。但轴突变性的机制一直不清，目前仍没有找到保护神经轴突、抑制变性的有效方法。 近年来探索轴突变性机制的研究多数是围绕Wlds鼠开展的。研究发现轴突变性延缓鼠的突变基因功能是由烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶（nicotinamide mononucleotide adenylyl—transferase1，Nmnat1）介导的。由于Nmnat1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）合成的关键酶，因此，一些学者推测NAD可能参与轴突变性，并开始进行实验研究NAD对轴突的保护作用。结果发现NAD与神经轴突变性密切相关，加入NAD后，可以使切断的神经轴突保持长时间不发生溃变，但是NAD保护神经轴突的最佳保护条件尚不清楚，尤其是NAD的作用机理不明。NAD是多种前体物质的合成物，包括色氨酸，烟酸，尼克酰胺和尼克酰胺肌苷等，它在能量代谢、氧化损伤、细胞老化等生物学过程中发挥着重要的调节作用。 作为NAD依赖性的脱乙酰化酶，沉默信号调控因子（silence signal regulating factor1，SIRT1）参与了基因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节。研究发现，SIRT1与神经系统疾病密切相关。在阿尔海默病中，诱导SIRT1表达可延缓神经元变性和死亡，活化SIRT1可产生神经保护作用，促进非淀粉样变性基因分裂，增强淀粉状蛋白β—肽的清除。SIRT1是否参与了NAD的轴突保护作用尚不清楚。 为了检测NAD的轴突保护作用，探讨NAD保护作用与浓度及时间的依赖性关系，并检测SIRT1与轴突变性的关系，我们设计了本项实验：建立了长春新碱毁损的背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）轴突变性细胞模型；在此模型上，观察了不同浓度的NAD对损伤轴突的保护作用，通过MTT分析、NF染色、轴突计数、轴突长度检测等观察了轴突变性的情况；应用透射电镜技术从超微结构上观察了轴突的变化；应用RT—PCR、Western blotting技术从mRNA水平及蛋白水平检测了SIRT1的表达变化，以期观察NAD的轴突保护作用，揭示SIRT1与NAD保护神经轴突的关系。 结果显示，刚接种的DRG呈圆形，24h后伸出突起。培养5d时，可见大量长短不一的轴突；加入长春新碱毁损8h后，在倒置显微镜下观察，发现轴突从远端开始肿胀、碎裂。我们在实验中选用0．005mmol/L、0．01mmol/L、0．02mmol/L，的长春新碱来建立轴突变性细胞模型，其中0．01mmol/L浓度组轴突变性最为明显，易于观察。在NAD轴突保护与作用浓度的依赖性关系实验中，选用0．5mmol/L、1．0mmol/L、2．0mmol/L三种浓度的NAD，观察了它们对轴突的保护作用，结果显示1．0 mmol/L NAD对轴突保护作用明显，0．5mmol/L NAD、2．0mmol/LNAD保护作用均弱于1．0mmol/L NAD；在NAD作用时间对轴突保护的实验中，我们在毁损前、毁损同时及毁损后加入了NAD来观察作用时间与轴突保护作用的关系，结果显示在毁损前加入NAD有轴突保护作用，在轴突毁损的同时及毁损后加入NAD，没有检测到明显的保护作用；为了进一步明确NAD作用时间与轴突保护作用的关系，我们分别将NAD预孵育12h、24h及36h，然后检测轴突保护作用。结果显示，NAD预孵育12h后轴突保护作用不明显，预孵育36h保护作用与预孵育24h没有明显的区别。在NAD不同作用浓度及作用时间的实验中，以1．0mmol/LNAD预孵育24h的轴突保护作用最明显。因此，本研究后续部分实验采用1．0mmol/LNAD预孵育24h来检测神经轴突的保护作用。MTT分析结果显示，NAD预孵育24h后，0．5mmol/L、1．0mmol/L、2．0mmol/LNAD的OD值均明显高于单纯毁损组（P<0．01），其中1．0mmol/LNAD的OD值最高。神经微丝（neurofilament，NF）免疫细胞化学染色结果显示，1．0mmol/L NAD预孵育24h组神经轴突排列有序，0．01mmol/L长春新碱毁损组轴突排列稀疏，长度较短。轴突计数结果显示，1．0mmol/LNAD预孵育24h后，轴突数明显多于0．01mmol/L，长春新碱毁损，结果有显著差异（P<0．05）。轴突长度分析结果显示，1．0mmol/LNAD预孵育24h组在不同时间段轴突长度均明显长于单纯长春新碱毁损组（P<0．01）。透射电镜结果显示，正常培养5d的DRG轴突形态规则，神经丝沿轴突长轴平行排列，轴浆中偶见细胞器。0．01mmol/L长春新碱毁损组内质网及线粒体空泡化，在轴浆和细胞器逐渐积聚，出现反应性轴突肿胀，导致轴突的离断，大量髓样小体出现；微丝微管排列紊乱，聚集，溶解，被絮状沉淀物和膜性结构所代替。1．0mmol/L NAD预孵育24h组中，髓样小体较少，可见较多的平行排列的微丝微管，轴突肿胀较轻。在进一步探讨NAD作用机理研究中，我们检测了SIRT1的mRNA表达情况，RT—PCR结果显示，正常培养5d的DRG中SIRT1基因有表达，0．01mmol/L长春新碱毁损组SIRT1基因表达量明显降低，加入NAD后，SIRT1基因表达较毁损组上调；Western blotting结果显示SIRT1的表达情况，0．01mmol/L长春新碱毁损组中SIRT1的表达明显下调，而加入NAD保护后SIRT1蛋白表达较毁损组上调，正常培养5d的DRG的蛋白表达量最高。 本项实验表明，NAD可以延缓长春新碱导致的轴突变性，其中1．0mmol/L的NAD预孵育24h所产生的轴突保护作用最明显。SIRT1是NAD依赖性的脱乙酰化酶，在NAD作用后表达明显升高，可能参与了神经轴突保护作用。

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