ROCKⅡ特异抑制性小分子多肽促进大鼠脊髓损伤后轴突再生与神经功能恢复的实验研究

摘要

目的：观察ROCKII特异抑制性小分子多肽对大鼠脊髓损伤后轴突再生与神经功能恢复的影响。方法：⑴选择健康雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠共210只,将其随机分为A-G共7组,每组30只。其中,A组为正常组,不做任何处理;B组为假手术组,造模手术仅咬开椎板,未损伤脊髓;C—G组大鼠均采用WD法制成T8-T10平面以下截瘫的脊髓损伤模型,并在约L4平面将注药用灌注软导管植入其蛛网膜下腔;C组作为空白对照组,不注射任何药物;D-G组经软导管用微量注射器注射药物,均为伤后1h开始注入,每天一次,共使用14天;其中D组为PBS液组,每次注射20μL PBS;E组为脂质体组,每次注射20μL脂质体溶液;F组为Y27632组,每次注射20μL(30μM) Y27632;G组为多肽组,每次注射脂质体20μL+8μgROCKII竞争抑制性小分子多肽。⑵各组于术后8h、24h、72h、1w、2w分别随机选取5只大鼠进行灌注取材、石蜡固定。(3)进行以下处理:①取各实验组标本进行HE染色,观察组织变化情况;②取术后8h、24h、72h、1w标本行TUNEL染色,观察计算凋亡细胞数;③取术后24h、72h、1w、2w标本按照SP法进行免疫组化,观察生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达;④每组随机选择5只大鼠在术后3w、6w、8w时分别进行体感诱发电位(SEP)测定,观察比较各组波幅和潜伏期情况;⑤各组术后3w、6w、8w时分别行BBB评分;⑥术后8w时通过双侧坐骨神经逆行示踪,观察各组轴突生长情况。(4)各组实验数据采用±s表示,全部采用SPSS11.5统计软件作单因素方差分析。结果：(1)HE染色:损伤区G组的神经元细胞及神经胶质细胞比其它各组明显要多,而变性细胞及红细胞则明显比其他组稀少,组织水肿和空洞形成也较轻;(2)GAP-43的表达情况:术后24h各组表达水平(mm2):A组31.04±1.51,B组32.05±1.43,C组43.17±2.00,D组42.90±2.64, E组43.13±1.84,F组74.70±2.36,G组82.92±3.08;术后72小时各组表达水平(mm2):A组31.61±1.11,B组32.72±2.13,C组52.30±1.97,D组53.33±2.07,E组53.23±3.13,F组85.07±2.78, G组94.40±3.30;术后1W各组表达水平(mm2):A组31.37±1.48,B组34.07±2.74,C组85.5±4.11,D组86.31±3.45,E组86.21±3.73, F组106.75±5.94,G组113.33±7.29;术后2W各组表达水平(mm2):A组31.11±1.50, B组34.86±3.70, C组45.24±4.93,D组45.57±11.8,E组48.54±4.08,F组158.05±5.78,G组169.37±7.96。在各个时间点,F组和G组GAP-43面积均大于C、D、E组(P<0.01),差异有统计学意义;而C、D、E组无明显统计学差异(P>0.05);A组和B组之间也无明显统计学差异(P>0.05);G组GAP-43面积均大于F组,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)各组凋亡细胞数:术后8h各组凋亡细胞数:A组7.86±1.45, B组9.33±2.44,C组49.67±5.83,D组50.27±3.80,E组50.53±4.69, F组42.2±6.20,G组39.33±5.35;术后24h各组凋亡细胞数:A组8.60±1.12,B组10.27±2.76,C组54.87±4.61,D组54.87±4.96, E组54.73±4.33,F组45.13±3.72,G组40.47±4.75;术后72h各组凋亡细胞数:A组8.47±1.46,B组9.33±1.84,C组45.67±3.39,D组46.27±5.18,E组45.93±6.91,F组38.00±5.93,G组31.53±4.96;术后1w各组凋亡细胞数:A组7.40±1.30,B组7.80±1.08,C组15.73±1.79,D组15.60±1.84,E组15.53±2.03,F组12.27±1.90, G组10.33±2.79。在各个时间点,F组和G组凋亡阳性细胞数均小于C、D、E组(P<0.05),差异有统计意义;C、D、E组无明显统计学差异(P>0.05);A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05);G组凋亡细胞数均小于F组,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)逆行示踪荧光面积:损伤节段各组荧光面积(mm2):A组192.78±6.14,B组193.88±4.12, C组23.86±2.69, D组23.50±1.70, E组24.90±2.25, F组58.16±1.91,G组65.02±3.10;损伤节段以上各组荧光面积(mm2):A组192.78±6.14, B组193.88±4.12,C组11.32±1.47,D组11.48±1.39,E组11.64±1.39,F组25.60±2.26,G组32.28±2.49。损伤节段及损伤节段以上F组和G组荧光面积均大于于C、D、E组(P<0.05),差异有统计意义, C、D、E组之间差异无明显统计学意义(P>0.05);B组-G组荧光面积均小于A组,有统计学差异(P<0.01);G组荧光面积均大于 F组,有统计学差异(P<0.05)。(5)SEP波幅及潜伏期:各组术前潜伏期(ms):A组14.80±1.30, B组15.50±2.57, C组15.54±2.11,D组16.72±1.48,E组16.08±2.63,F组15.40±2.26,G组15.62±2.16;术后24h各组潜伏期(ms):A组16.10±1.39,B组15.96±3.60,C组37.44±5.12,D组36.84±5.46,E组36.52±4.36,F组37.56±4.90,G组38.30±1.46;术后3w各组潜伏期(ms):A组14.44±0.64,B组16.02±3.46,C组35.74±3.87,D组35.60±5.32,E组35.46±3.56,F组31.52±4.79, G组26.52±1.65;术后6w各组潜伏期(ms):A组14.68±0.22,B组16.26±1.38,C组31.48±1.63,D组29.07±4.56,E组30.72±0.66, F组26.76±1.78,G组23.28±2.10;术后8w各组潜伏期(ms):A组14.36±0.88,B组14.40±0.57,C组28.60±0.84,D组29.07±4.56, E组28.96±3.72,F组23.86±2.99,G组19.12±1.87。术前各组潜伏期均无统计学差异(P>0.05),术后24h C组—G组潜伏期和术前相比有统计学差异(P<0.01)。术后3w、6w、8w,各时间点G组和F组潜伏期均低于C、D、E组,差异有明显统计学意义(P<0.05);C、D、E组之间潜伏期无明显统计学差异(P>0.05);G组潜伏期低于F组,差异有统计学意义(P<0.05)。各组术前波幅(μV):A组15.18±3.26,B组15.56±2.79,C组15.62±1.96,D组14.74±2.00,E组16.02±3.32,F组15.06±2..25, G组15.22±2.29;术后24h各组波幅(μV):A组15.40±1.67,B组14.88±0.99,C组1.26±0.25,D组1.30±0.63,E组1.08±0.33,F组1.36±0.56,G组1.22±0.43;术后3w各组波幅(μV):A组14.96±3.39,B组16.06±3.00,C组1.46±0.48,D组1.36±0.42, E组1.32±0.56,F组4.84±0.49,G组6.92±0.36;术后6w各组波幅(μV):A组15.36±1.75,B组16.52±0.94,C组2.62±0.75,D组2.28±0.25,E组2.68±0.43,F组5.86±0.86,G组9.48±3.19;术后8w各组波幅(μV):A组15.12±0.94,B组16.18±2.46,C组2.82±0.39,D组2.92±0.44,E组3.22±0.54,F组6.96±0.78,G组10.09±3.27。术前各组波幅均无统计学差异(P>0.05),术后24h C—G组波幅和术前相比有明显统计学差异(P<0.01)。术后3w、6 w、8w,各时间点G组和F组波幅均高于C、D、E组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D、E组之间无明显统计学差异(P>0.05);G组波幅均高于F组,二者之间有明显统计学差异(P<0.05)。(6)BBB评分情况:术后3w、6 w、8w时间点A、B两组评分均为21分。术后3w C组-G组评分为:C组5.4±0.55,D组5.0±1.87,E组5.2±0.84,F组8.0±1.87,G组10.0±2.0;术后6 w C-G组评分为:C组5.6±1.34, D组5.8±1.92, E组5.8±1.79,F组9.4±1.52,G组12.0±2.35;术后8w C-G组评分为C组8.0±1.58, D组8.2±2.28,E组8.0±1.58, F组13.4±1.34,G组15.8±1.79。各时间点G组、F组评分和C、D、E组之间有统计学差异(P<0.01);G组评分大于F组,有统计学意义(P<0.01);而C、D、E组之间无统计学意义差异(P>0.05)。结论：ROCK II特异抑制性小分子多肽能促进脊髓损伤后轴突再生和神经功能恢复,且效果优于Y-27632。

目录

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2.实验方法、步骤

3.统计学处理

结果

1.HE染色结果

2. 生长相关蛋白（GAP-43）的表达

3.大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的表达情况比较

4 逆行示踪

5.体感诱发电位（SEP）

7. BBB评分

讨论

1. RockII在脊髓损伤后轴突再生抑制信号传递中的关键作用

2. ROCK II 特异抑制性小分子多肽促进脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

脊髓损伤后轴突再生修复进展吴韬韬 （综述）

1. SCI后轴突再生修复困难的因素

2.脊髓损伤后轴突再生修复策略

3.问题与展望

参考文献