人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

摘要

B19属于细小病毒科红病毒属。对于免疫功能正常的人群，B19主要引起儿童传染性红斑（又称第五病）和成人类风湿样急性多关节病；而对于免疫力低下者，感染B19会引起单纯红细胞再生障碍及慢性贫血；对于孕妇，B19感染严重时可致胎儿水肿，宫内死胎等。B19病毒主要经呼吸道传播，也可通过输血传播和母婴传播。 由于国内目前还没有商品化的B19检测试剂，有必要建立B19的血清学检测方法。血清B19IgG检测可用于发现既往感染；另外输注B19IgG阳性的血液，有利于防止B19的输血传播。B19病毒IgM抗体检测方法可用于急性感染的诊断。 建立抗体检测的血清学检测方法需要有足量的病毒抗原，B19目前在体外难以培养，病毒抗原的制备只能采用基因工程的方法。B19衣壳由VP1和VP2两种蛋白组成，VP2占96％。VP2在哺乳动物或昆虫细胞中表达时能够自我组装成形态结构及免疫原性均与天然病毒粒子相似的病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs），能有效地结合构象型抗体，是用于血清抗体检测的理想抗原。 本研究拟通过原核和昆虫细胞表达B19VP2蛋白制备VLPs，B19VLPs的制备将为B19病毒的血清学检测方法的建立打下基础。 一、Sf9细胞中表达VP2蛋白及B19病毒样颗粒的制备实验 目的：在昆虫细胞Sf9中表达B19VP2蛋白，制备VLPs。 方法：设计合成60条引物，PCR为基础的两步DNA合成方法（PCR-basedtwo-stepDNAsynthesis，PTDS）人工合成VP2基因编码区，末端加A后连接至pMD18-T载体，得到质粒pMD-VP2。NdeI/XhoI从pMD-VP2质粒切下VP2基因，亚克隆到pFast-BacI载体，转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E．coliDH10Bac感受态细胞，获得的重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2；在脂质体（CellfectinReagent）介导下转染Sf9昆虫细胞，包装重组杆状病毒rBac-VP2，测定rBac-VP2滴度。10MOI（感染复数）rBac-VP2感染Sf9细胞，待细胞病变明显，收取Sf9细胞，少量用于间接免疫荧光实验（lFA）、Westernblotting方法鉴定VP2蛋白表达情况，剩余部分超声破碎，上清采用蔗糖垫层超速离心及非连续CsC1密度梯度超速离心方法分离纯化。纯化产物经磷钨酸负染后电镜观察病毒样颗粒的形成情况。 结果：成功构建重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2，转染Sf9细胞后包装出重组杆状病毒rBac-VP2，滴度2．5×107IU/ml。10MOIrBac-VP2感染Sf9细胞，IFA及Westernblotting检测表明VP2得到表达。超速离心纯化后，于CsC1密度为1．20g/ml处的蛋白层中能观察到大小约22nm的VLPs。 结论：利用杆状病毒表达系统制备了细小病毒B19VLPs。 二、VP2蛋白的原核表达实验 目的：通过原核表达B19VP2制备VLPs。 方法：酶切pMD-VP2将VP2基因以不同方法亚克隆到pET-30a（+）载体，得到pET-VP2（表达完整VP2蛋白）或pET-HVP2（表达N端融合His标签的VP2），转化BL21（DE3）菌株，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达；或将VP2基因亚克隆到pBV220载体，得pBV-VP2，转化DH5α菌株，通过改变培养温度诱导表达完整蛋白。无标签的VP2包涵体在变性、复性后使用DEAE琼脂糖阴离子交换柱纯化；带His标签的VP2在变性条件下使用固化金属层析柱纯化；十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Westernblotting分析纯化后的蛋白。电镜负染技术用于检测VLPs的形成。 结果：合成得到VP2基因的编码区，并成功构建质粒pET-VP2、pET-HVP2及pBV-VP2。SDS-PAGE结果表明VP2目的蛋白以包涵体形式表达；包涵体变性、复性并经多种层析方法处理后，目标蛋白均未得到纯化；电镜观察也未见VLPs。Westernblotting结果可见多数蛋白条带均能与B19VP2抗体特异性结合，它们可能是VP2的不同截短体。 结论：在原核细胞VP2蛋白以包涵体形式表达，产量高，变性后复性操作容易；但原核表达可能产生了多种VP2截短体，给纯化和VLPs的自组装造成困难。虽然未得到纯化的VP2蛋白及其VLPs，但原核表达的实践为我们进一步改进实验设计指明了方向。 综上所述，我们合成细小病毒B19衣壳蛋白VP2基因编码区，构建了原核表达质粒及重组杆状病毒表达质粒，在细菌或昆虫细胞中获得了表达，从表达VP2的昆虫细胞能够分离纯化得到VLPs。本研究为B19病毒的血清学检测方法的建立打下了基础。

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文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

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前 言

第一部分 Sf9细胞中表达VP2蛋白及B19病毒样颗粒的制备

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 VP2蛋白的原核表达

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间论文发表情况

致 谢