谷胱甘肽转硫酶Mu亚型在糖尿病肾病发病中的作用及干预治疗的实验研究

摘要

糖尿病肾病是糖尿病患者最主要的微血管病变，发病率高，美国疾病控制中心资料显示，DN患者约占DM总人数的67％以上。据美国、日本及许多西欧国家统计资料表明，DN已经上升为终末期肾脏病的首位病因，在美国、日本的透析患者中，DN患者所占比例接近50％。随着生活水平的提高和生活方式的变化，我国DM和DN发病率也成上升趋势。目前临床上早期诊断DN的主要依据是微量蛋白尿，而DM患者一旦出现微量蛋白尿，约有30～45％的DN患者将不可避免地进展到明显蛋白尿进而发展至慢性肾功能衰退及ESRD。由于DN患者机体存在极其复杂的代谢紊乱，一旦发展至终末阶段，往往比其他肾脏疾病治疗更加棘手。而目前临床尚缺乏针对DN有效的特异性治疗。由于DM患者，尤其是2型DM患者常伴有代谢综合征的其他表现，如高血压、高脂血症、中心性肥胖等，因此临床上针对DN的治疗以综合治疗为主，包括控制血糖、控制血压、降脂治疗及终末期替代治疗等，而治疗费用昂贵、疗效差和患者病死率高，一直是糖尿病领域和肾脏病领域学者面临的问题。进一步探索DN的发病机制，以便制定更加有效的防治措施无疑是当今医学界急待解决的重大课题。
　　 DN发病机制十分复杂，包括了众多因素参与。总的来说，它是起始于糖代谢障碍所致的血糖过高，在一定遗传背景以及一些相关的获得性危险因子参与下，通过启动许多细胞因子网络，终于造成肾脏的损害。虽然有关DN的研究取得了很大的进展，但其发病机制尚未完全清楚。近年来，蛋白质组学技术在肾脏领域的研究逐渐增多，这对于深入了解肾脏的生理功能、揭示肾脏病的发病机理、发现新的诊断标志物以及识别新的治疗靶点有着深远的意义。而蛋白质组学技术也为深入研究DN发病机制提供了全新的方法。
　　 本论文我们利用蛋白质组学技术对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究，并进一步对其中的差异表达蛋白——谷胱甘肽转硫酶Mu亚型在DN进展中的作用及干预治疗的意义进行了探讨。
　　 第一部分 GSTM在STZ诱导的DM大鼠肾脏表达的研究
　　 研究背景和目的：
　　 随着人类基因组计划工作的完成，生物医学领域已经开始在基因水平对各种疾病进行深入的研究，但人们也逐渐认识到基因只是遗传信息的载体，而生理活动的执行者是基因的表达产物——蛋白质，要研究生命现象、阐明生命活动规律，需要对蛋白质进行全面的研究。只有对蛋白质数量、结构、性质、相互关系和生物功能全面认识，才能揭开生命现象的本质。因此，蛋白质组学已成为“后基因组时期”生物医学研究的重点内容之一。
　　 近年来，蛋白质组学技术在肾脏领域的研究也逐渐增多，这对于深入了解肾脏的生理功能、揭示肾脏病的发病机理、发现新的诊断标志物以及识别新的治疗靶点有着深远的意义。而蛋白质组学技术也为深入研究DN发病机制提供了全新的方法。
　　 论文第一部分我们利用蛋白质组学技术对STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究，以寻求糖尿病肾病可能的发病机制和治疗的新靶点。
　　 材料和方法
　　 健康雄性Wistar大鼠40只，随机选取12只作为正常对照组，其余28只用来建立糖尿病大鼠模型，作为糖尿病组。正常对照组一次性尾静脉注射0.1％柠檬酸缓冲液，DM组一次性尾静脉注射0.1％STZ柠檬酸缓冲液55mg/kg，5天后取鼠尾血测定血糖，筛选模型成功的大鼠。以STZ注射5天后空腹血糖水平≥16.7mmol/L为糖尿病模型成功的标准。所有大鼠标准饲料喂养，自由饮水，持续观察24周。于第24周末处死大鼠，取血测定空腹血糖、尿素氮、肌酐、白蛋白、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、糖基化血红蛋白和晚期糖基化终末产物；留尿测定24小时尿蛋白；取肾组织PAS染色观察肾脏病理改变，应用双向凝胶电泳和质谱鉴定方法比较DM大鼠肾组织蛋白质的差异表达。
　　 结果：
　　 1.第24周时DM组大鼠FPG、HbA1c、AGEs水平与C组相比较均显著升高；24h尿蛋白定量较C组大鼠增多。
　　 2.光镜下PAS染色显示，与C组比较，DM组大鼠肾小球ECM增多，系膜细胞增生，同时毛细血管部分塌陷，肾小囊部分粘连。
　　 3.双相电泳及质谱分析发现的DM大鼠肾组织的差异表达蛋白25个，其中上调点13个，下调点12个，其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等。
　　 4.25个差异表达的蛋白中GSTM在DM组表达较C组上调。Westen Blot检测发现DM组大鼠肾组织GSTM的表达也较C组显著增高，与蛋白质组学结果一致。
　　 结论：
　　 1.蛋白质组学技术是研究DN的发病机制和治疗的新靶点的有效方法；我们利用双相电泳及质谱分析发现的DM大鼠肾组织的差异表达蛋白25个，其中上调点13个，下调点12个，其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等，这些差异表达的蛋白可能参与DN的发病。
　　 2.对两组大鼠肾组织GSTM的表达进行检测，发现DM组大鼠肾组织GSTM的表达较C组增高，提示GSTM可能在DN的发病中起一定的作用，我们将在今后工作中做进一步深入的研究。
　　 第二部分高糖诱导大鼠系膜细胞GSTM的表达及干预治疗的实验研究
　　 研究背景和目的：
　　 系膜细胞是肾脏固有细胞之一，具有多种生理功能，在病理情况下，MC与其他肾脏组织细胞一样，不但是疾病的受害者，而且也是直接的参与者。它能通过自身细胞的增殖及转分化，通过产生各种致炎、致纤维化物质而影响疾病的进程。事实上，MC增生及系膜硬化是最为常见的对各种肾小球损伤的反应。利用体外培养的MC进行细胞生物学研究，对深入了解肾脏的生理及病理生理的变化，了解各种肾脏疾病的发病机制具有十分重要的作用。
　　 DN在组织学上的特征性改变包括肾小球基底膜增厚和系膜基质合成增多，而系膜基质合成增多主要是由MC产生增多。久而久之，肾脏出现肾小球硬化，相应的肾小管萎缩、肾间质纤维化，可见MC在DN的发生和发展中起重要作用。
　　 由于以上原因，我们选择了体外培养的大鼠系膜细胞，研究高糖刺激下GSTM在RMC的表达情况及抗氧化剂白藜芦醇干预治疗的意义，以期了解GSTM在DN发病中的作用。
　　 材料和方法：
　　 常规体外培养大鼠系膜细胞，分为5组：①正常对照组(C组)；②高糖组(HG组)；③高糖+2.5μM白藜芦醇组(T1组)；④高糖+5μM白藜芦醇组(T2组)；⑤高糖+10μM白藜芦醇组(T3组)。治疗组相应浓度白藜芦醇预孵育1h，在高糖条件下培养48h，应用MTT比色法和CCK8法测定系膜细胞增殖。收集细胞用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡，PI染色法检测细胞周期； Westen Blot检测系膜细胞GSTM和Nrf2的表达。
　　 结果：
　　 1.MTT比色法测定HG组较C组RMC增殖率增高，Res治疗后T2、T3组增殖率较HG组减低，T1组增殖率较HG组减低，但无统计学意义。CCK8法测定HG组增殖率较C组增高，Res治疗后T1、T2、T3组均较HG组增殖率减低，且三个治疗组间增殖率有差异，随Res浓度增加增殖率降低。
　　 2.HG组G1期细胞比例较C组增高(P＜0.05)，Res治疗后T3组G1期细胞比例较HG组减少(P＜0.05)，而T1、T2组G1期细胞比例虽较HG组减少，但无统计学意义(P＞0.05)。HG组S期细胞比例较C组减少(P＜0.01)，Res治疗后T2、T3组S期细胞比例较HG组增高(P＜0.01)。三个治疗组间T2、T3两组S期细胞比例较T1组增高(P＜0.05)，T2与T3组之间无差别(P＞0.05)。各组间G2期细胞比例无差异(P＞0.05)。
　　 3.HG组细胞凋亡率与C组无差别(P＞0.05)，Res治疗后T2、T3组凋亡率较HG组增加(P＜0.01)，T1组凋亡率虽较HG组增高，但无统计学差异(P＞0.05)。
　　 4.HG组GSTM表达较C组增高(P＜0.001)，Res治疗后T2、T3组GSTM表达较HG组减低(P＜0.01)，T1组GSTM表达较HG组减低，但无统计学差异(P＞0.05)。三个治疗组之间GSTM表达均有差异(P＜0.05)，随Res浓度增加GSTM表达减少。
　　 5.HG组Nrf2表达较C组增高(P＜0.001)，Res治疗后T2、T3组Nrf2表达较HG组减低(P＜0.01，P＜0.001)，T1组Nrf2表达较HG组减低，但无统计学差异(P＞0.05)。三个治疗组之间Nrf2表达有差异(P＜0.05)，随Res浓度增加Nrf2表达减少。
　　 结论：
　　 1.在高糖刺激下，系膜细胞GSTM表达上调，这可能是DM大鼠肾组织GSTM表达上调的原因之一。
　　 2.Res干预治疗高糖刺激下的RMC，下调GSTM表达对RMC起保护作用。Res下调系膜细胞GSTM表达是通过调节上游基因Nrf2的表达实现的。
　　 3.Res能抑制高糖诱导的RMC增殖，且抑制作用存在一定的量效依赖关系。
　　 (1)Res抑制RMC的增殖与影响RMC的细胞周期有关。Res能抑制RMC从S期进入G2/M期，将RMC阻滞于S期，对高糖诱导的RMC增殖起抑制作用。
　　 (2)诱导RMC凋亡也在Res抑制RMC增殖中起一定作用。Res下调RMC的GSTM表达，从而激活ASK1介导的MAPK通路，促进了RMC的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分 GSTM在糖尿病大鼠肾脏表达的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文附图表

参考文献

第二部分 高糖诱导大鼠系膜细胞GSTM的表达及干预治疗的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文附图表

参考文献

Part Ⅰ The Expression of Glutathione S—transferase Mu on the Kidney of Diabetic Rats

Prat Ⅱ Effects of resveratrol on high glucose-induced mesangail cell proliferation

综述： 蛋白质组学在糖尿病肾病研究中的应用现状

攻读博士学位期间发表的论文

致谢