携有鼠胰岛素样生长因子1重组腺病毒对胰岛β细胞的保护性研究

摘要

研究背景：
　　 1型糖尿病是自身免疫性疾病，以T淋巴细胞介导、巨噬细胞浸润，最终导致胰岛β细胞自身免疫性破坏。同时，胰岛β细胞凋亡对糖尿病的发生发展也起重要作用。T1D占糖尿病总患病率的10％，近年来发病率逐年上升，据报道全球患病率以每年3％的速度增长，预计2010年将比1998年的患病率增加40％。
　　 近年来运用基因重组技术和转基因技术，将目的基因转入靶细胞，使靶细胞组织局部高表达目的基因已成为现实。胰岛β细胞局部表达细胞因子IGF-1将有助于保护胰岛β细胞功能和促进胰岛β细胞存活再生，IGF-1可能具有防治1型糖尿病的作用。
　　 目的：
　　 本研究首先利用腺病毒载体构建携带大鼠胰岛素样生长因子1的重组腺病毒，检测重组腺病毒滴度、目的基因是否有效合成和表达，Ad-rIGF-1是否能够转染鼠胰岛β细胞。链脲佐菌素具有选择性破坏胰岛β细胞的作用，被广泛用于建立糖尿病动物模型，在体外研究中诱导胰岛β细胞损害。Ad-rIGF-1转染鼠胰岛β细胞后，利用STZ诱导β细胞破坏，观察鼠胰岛β细胞的胰岛素释放功能、细胞存活率以及细胞凋亡，探讨STZ诱导鼠胰岛β细胞破坏的机制，以及rIGF-1对胰岛β细胞的保护机制；为下一步rIGF-1防治1型糖尿病的动物实验、IGF-1作为候选基因用于1型糖尿病的防治，提供实验基础和理论基础。
　　 方法：
　　 1、重组腺病毒载体的构建和鉴定，重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定
　　 取鼠肝脏组织，TRIZOL一步法提取总RNA，cDNA第一链合成采用逆转录试剂盒，以其为模板，PCR反应扩增rIGF-1 cDNA。RT-PCR纯化产物和pAdTrack-CMV分别经BglⅡ和EcoR V双酶切，凝胶回收酶切产物，经T4 DNA连接酶过夜连接。反应产物转化感受态的大肠杆菌JM109，卡那霉素平板筛选阳性克隆扩增培养，正确克隆命名为pAdTrack-rIGF-1，送上海生工测序。将正确重组pAdTrack-rIGF-1穿梭质粒经PmeI酶切，完全线形化后转化包含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183，进行同源重组。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，鉴定正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-rIGF-1。
　　 pAd-rIGF-1质粒经PacI酶切，在脂质体Lipofectamine2000介导下转染293细胞。转染后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，第7天在出现明显细胞病变效应后收集病毒，命名为Ad-rIGF-1。同样条件包装扩增不含目的基因的空腺病毒载体，作为病毒载体对照，命名Ad-eGFP。测定病毒滴度。
　　 2、转染RINm-5F细胞目的基因表达的检测
　　 RINm-5F细胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。当细胞80％汇合时，以约l×106pfu/ml的Ad-rIGF-1、Ad-eGFP直接转染，培养48h，之后进行下列实验检测。
　　 3、转染细胞目的基因和产物的检测
　　 ①RT-PCR：收集转染后RINm-5F细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，以DNase酶消化去除DNA污染，RT-PCR扩增目的基因片段。
　　 ②ELISA：收集上述细胞培养液上清，ELISA法检测目的基因的表达。
　　 ③Western blotting：转染48h后裂解细胞，以SDS-PAGE分离蛋白，一抗为羊抗鼠IGF-1特异多克隆IgG，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗羊IgG为二抗进行Westernblotting分析。
　　 4、胰岛素释放试验和NO测定
　　 6个实验组(对照组、STZ组、Ad-IGF-1组、Ad-IGF-1+STZ组、Ad-eGFP组、Ad-eGFP+STZ组)，分别加入含有终浓度为0和/或1.5mmol/L STZ的培养液，培养24h。收取培养上清液，Griess反应测NO；以不含血清的RPMI1640培养液清洗细胞2遍，加入含10％FBS的RPMI1640培养液培养24h；不含血清的RPMI1640培养液清洗细胞后，加入含终浓度16.7mmol/L葡萄糖、0.2％BSA的无血清1640培养液，37℃培养60min，取培养上清检测胰岛素。
　　 5、RINm-5F细胞凋亡的检测
　　 如上所述的6个实验组，待病毒转染和STZ处理相应组后，用含0.25％胰酶和0.2％EDTA的消化液消化并吹散细胞，计数5×105个细胞以PBS洗涤收集，70％冰预冷乙醇固定，PI避光染色，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　 6、细胞存活率分析
　　 RINm-5F接种96孔培养板，每孔1×105个细胞，培养24h后，细胞处理方式同前，之后弃去培养液，加入1mg/ml MTT于37℃孵育3h，弃去MTT加入二甲亚砜，振摇15min，取490nm测定光密度值，计算细胞存活率。细胞存活率是以对照组细胞存活率为100％，实验各组细胞存活率=(各实验组OD均值/对照组OD均值)×100％。
　　 结果：
　　 1、成功构建重组腺病毒
　　 RT-PCR合成rIGF-1 cDNA产物，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约406bp清晰的电泳条带。构建的pAdTrack-rIGF-1穿梭质粒，以BglⅡ和EcoRV双酶切经琼脂糖凝胶电泳分析，得到406bp和9200bp2个片段，与预期值相符；测序结果与GenBank报道一致。重组腺病毒载体pAd-rIGF-1经PacⅠ酶切后，电泳可观察到一条大的DNA片段和一条较小的DNA片段。经PacⅠ酶切线形化的pAd-rIGF-1和pAd-eGFP分别转染293细胞，16h后荧光显微镜见到GFP的表达。快速腺病毒感染法滴度检测，Ad-rIGF-1滴度：4.0×108pfu/ml；Ad-eGFP滴度：8.5×108pfu/ml。
　　 2、Ad-rIGF-1转染RINm-5F细胞目的基因表达的检测
　　 ①RT-PCR：Ad-rIGF-1转染RINm-5F的细胞，提取细胞RNA经DNase酶消化后，扩增得到406bp目的条带，Ad-eGFP转染细胞和对照组RINm-5F细胞没有目的条带。
　　 ②ELISA：Ad-rIGF-1转染RINm-5F细胞48h，收取培养上清，ELISA法测鼠rIGF-1蛋白，71.60±10.33 ng/ml，对照组RINm-5F细胞和Ad-eGFP转染细胞培养上清中未检测到该蛋白表达。
　　 ③Western blotting：转染Ad-rIGF-1的RINm-5F细胞有特异性rIGF-1条带，对照组RINm-5F细胞和Ad-eGFP转染细胞无此特异性条带。
　　 以上结果证明重组腺病毒Ad-rIGF-1能够有效转染RINm-5F细胞，目的基因能够在转染后RINm-5F细胞有效合成和释放。
　　 3、rIGF-1对STZ作用大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素的影响
　　 对照组、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP转染RINm-5F细胞胰岛素释放量差异无显著性(P＞0.05)；STZ作用后，明显降低RINm-5F细胞和Ad-eGFP预处理组RINm-5F细胞胰岛素释放量(P＜0.01)，而Ad-rIGF-1预处理组与对照组胰岛素释放量差异无显著性。
　　 4、培养上清中NO含量测定结果
　　 对照组、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP转染RINm-5F细胞组培养上清NO差异无显著性(P＞0.05)；STZ作用后，STZ组和Ad-eGFP预处理组RINm-SF细胞NO产量明显高于对照组(P＜0.05)；而Ad-rIGF-1预处理组能明显抑制NO的产生，并与对照组差异无显著性(P＞0.05)。rIGF-1能够阻止STZ诱导的NO产生和释放。
　　 5、rIGF-1对胰岛β细胞凋亡的影响
　　 STZ组、Ad-eGFP+STZ组RINm-SF细胞凋亡率较对照组明显增加(P＜0.01)；经Ad-rIGF-1预处理的Ad-IGF-1+STZ组，可有效抑制STZ致细胞凋亡作用，细胞凋亡率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。
　　 6、rIGF-1对胰岛β细胞存活率的影响
　　 STZ组、Ad-eGFP+STZ组RINm-SF细胞存活率较对照组明显降低(P＜0.01)；而经Ad-rIGF-1预处理的Ad-IGF-1+STZ组，RINm-5F细胞则可抵抗STZ的细胞毒性作用，细胞存活率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。IGF-1可以明显提高细胞存活率。
　　 结论：
　　 1、本研究成功构建了高效表达大鼠胰岛素样生长因子1的重组腺病毒；
　　 2、从分子水平证明重组腺病毒Ad-rIGF-1能够有效表达；
　　 3、表达产物具有良好的生物学活性；
　　 4、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能保护细胞功能，即胰岛素合成释放活性；
　　 5、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能抑制链脲佐菌素引起细胞一氧化氮产生；
　　 6、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能保护胰岛β细胞免于诱导凋亡因子的损害；
　　 7、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能提高细胞存活力和存活率；
　　 8、STZ诱导胰岛β细胞功能损害、细胞凋亡及降低细胞活性和存活率与自由基一氧化氮介导有密切关系；
　　 9、RINm5F细胞可以作为糖尿病胰岛β细胞功能研究的有利工具；
　　 10、IGF-1基因可以作为防治1型糖尿病重要的候选基因之一。

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