辽东湾斑海豹MHC-DQB基因的遗传多样性分析

摘要

辽东湾斑海豹（Phocalargha）是惟一一种能在我国海域繁殖的鳍足类动物，在《国家重点保护野生动物名录》中被列为国家II级保护动物，其分布区域位于世界上8个繁殖区的最南端，已经与其他繁殖区域的斑海豹产生一定程度的隔离。辽东湾斑海豹数量己不足千头，环境污染、栖息地的破坏和猎捕等加剧了其自然种群数量的下降，种群状况已岌岌可危。虽然对辽东湾斑海豹开展了一定的研究和保护工作，但主要集中在形态结构、习性、分布特征以及人工饲养和繁殖上，大多数保护活动仍然是在缺乏保护遗传学研究的情况下进行的。因此，通过以往的研究不能准确全面的获得其保护遗传学信息。
　　 主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是具高度多样性的核基因，在阐明种群间的变异和适应机制方面更具优越性。通过MHC基因的变异分析，可有效评估种群遗传多样性水平。本文以辽东湾25份斑海豹样本为研究对象，分析了MHC-DQB第二外显子的基因多态性，探讨和评价了其种群遗传多样性水平，及在抵抗疾病和适应环境变化方面的能力和潜在威胁。
　　 从25份斑海豹样本的270多个克隆中，得到141bp的片段。在这些序列中发现21个变异位点，定义了12个等位基因。氨基酸变异率为25.5％。等位基因之间的遗传距离范围是0.0071～0.1064，平均值为0.0577，不同等位基因之问的碱基差异是l～15bp，平均差异数为8bp，表现出较丰富的遗传多样性。在56条序列中发现13种可疑序列，怀疑是非特异性扩增造成的微卫星序列。
　　 对核苷酸替代的类型及位点进行分析，发现非同义替换率明显高于同义替换率（平均dN/ds=2.07），由此造成的氨基酸替换集中在肽结合位点PBR附近，表明斑海豹的DQB基因受到强烈的正选择或平衡选择作用。大部分替换的氨基酸和被替换的氨基酸理化性质不同，这种理化性质的改变，可能与它们识别和提呈不同的抗原有关。
　　 构建的系统发育树及TCS网络图显示，鳍足类MHC基因表现出跨物种进化现象，ds值分析也支持这一结论。斑海豹DQB等位基因分布不平衡，稀有等位基因不成比例，暗示辽东湾斑海豹可能经历过遗传瓶颈效应。
　　 11个样本出现多于两条等位基因的情况，推测存在基因重复现象。DQB第二外显子包含两个富含GC的区域（即GCi和GCii），含类似X的序列，显示出一种纯粹的重组信号。根据系统发育数、中接网络图、TCS网络图和种群遗传结构分析对斑海豹的位点进行讨论，认为斑海豹的59个等位基因可能来自DQB的两个位点和DRB的一个位点。通过计算各个位点的单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸歧义度等遗传多样性参数，并与其他鳍足类的遗传距离、每个个体所含等位基因数、碱基及氨基酸变异等参数进行比较，发现各个位点的遗传多样性水平较高。通过Tajima'D检验和Fu'Fs检验，以及对非同义替换率与同义替换率进行比较，结果显示，DQB受到正选择的作用。这在一定程度上支持了达尔文的自然选择学说。
　　 基因重复和每个位点的基因多样性共同作用，使斑海豹MHC表现出丰富的多态性，可以最大限度的适应多变的病原体环境。但是，等位基因分布不平衡，如果稀有等位基因在遗传漂变的作用下在斑海豹种群中消失，将会导致斑海豹多样性的进一步丧失，从而丧失对多样化病原体的抵抗能力。因此，在保护斑海豹生存环境的同时，还必须尽可能多地保护物种的遗传多样性，才能真正达到保护物种的目的。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

缩略词

第1章 文献综述

引言

1.1 主要组织相容性复合体MHC及其在种群与保护遗传学中的应用

1.1.1 MHC的结构和功能

1.1.2 MHC的遗传特征

1.1.3 MHC的多态性及其产生机制

1.1.4 MHC在种群与保护遗传学中的应用

1.2 斑海豹研究概况

1.2.1 斑海豹简介

1.2.2 斑海豹的保护遗传学研究概况

1.3 本课题的研究目的和意义

第2章 辽东湾斑海豹MHC-DQB基因的遗传多样性分析

引言

2.1 材料

2.1.1 样品采集

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 基因组DNA提取

2.2.2 PCR-SSCP分型

2.2.3 PCR产物纯化、克隆与测序

2.2.4 数据分析

2.2.5 等位基因命名

2.3 结果与分析

2.3.1 PCR-SSCP分型结果

2.3.2 核苷酸序列测定结果与分析

2.3.3 氨基酸序列变异分析

2.3.4 DQB第二外显子的进化分析

2.4 讨论

2.4.1 PCR-SSCP分型结果与讨论

2.4.2 对可疑序列的讨论

2.4.3 关于MHC-DQB基因第二外显子高GC含量的讨论

2.4.4 关于MHC-DQB等位基因多态性的讨论

2.4.5 MHC-DQB的进化分析与讨论

2.4.6 不同分子标记的综合比较结果与讨论

第3章 辽东湾斑海豹MHC-DQB基因的位点个数讨论及多态性机制研究

引言

3.1 材料

3.2 方法

3.2.1 基因组DNA提取

3.2.2 PCR-SSCP分型

3.2.3 PCR产物纯化、克隆与测序

3.2.4 数据分析

3.3 结果与分析

3.3.1 斑海豹DQB等位基因的检测与分析

3.3.2 斑海豹DQB基因的位点个数分析

3.3.3 DQB等位基因选择作用的检测

3.3.4 多样性分析

3.4 讨论

3.4.1 关于斑海豹DQB基因的位点个数分析与讨论

3.4.2 DQB等位基因选择作用的检测结果与讨论

3.4.3 多样性分析与讨论

第4章 结论和展望

引言

4.1 结论

4.2 实验中存在的问题

4.3 保护建议

4.4 展望

附录

参考文献

致谢

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