川芎嗪茋类衍生物对K562/A02细胞的耐药逆转作用及机制研究

摘要

肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，化学药物为其治疗的重要手段，但肿瘤细胞产生耐药性是影响化疗治疗效果的重要原因之一。MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果。目前认为多药耐药性形成的原因主要有ATP结合膜糖蛋白如P-糖蛋白(P-glyeoprotein,P-gp)的过表达或活性升高，谷胱甘肽-S-转移酶或蛋白激酶C的表达、活性增加，DNA拓扑异构酶Ⅱ的水平下降或性质改变以及抗凋亡蛋白的高表达，均可使肿瘤细胞产生耐受性。
　　 川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一，已有很多文献报道它具有逆转肿瘤多药耐药的活性，是中药拮抗肿瘤多药耐药的热点化合物之一。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成极性和水溶性较大的代谢物而被迅速排出体外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺点。经川芎嗪及其衍生物构效关系研究，证实吡嗪环为其基本药效基团；2，3，5，6位甲基为药代基团。芪类衍生物具有逆转多药耐药、抗肿瘤细胞侵袭、黏附等广泛的抗肿瘤活性，其代表化合物白藜芦醇抗肿瘤活性已被科学界所认可。因此，以白黎芦醇为结构模型，在保持其基本骨架不变的前提下，以吡嗪环替代其中一个苯环，即在川芎嗪侧链上引入取代苯乙烯基，设计合成了一系列川芎嗪芪类衍生物。以白藜芦醇的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团，以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点，并通过协同作用增强药效，提高肿瘤多药耐药逆转效果。在本课题中，对合成的该系列川芎嗪芪类衍生物进行了活性筛选，并对其中具有较好逆转活性的DLJ14在阿霉素白血病耐药株K562/A02中的多药耐药逆转作用及其可能机制进行了研究。
　　 在本课题中，首先采用MTT(溴化-(4，5)-二甲基-2-噻唑基－2，5－二苯基四噻唑）法检测K562/A02耐药倍数、化合物逆转活性以及化合物自身的细胞毒性作用。利用阿霉素的自发荧光测定K562/A02及K562细胞内阿霉素蓄积情况。
　　 对化合物DLJ14体外逆转MDR作用机制的研究，首先考察对P-gp耐药途径的影响。采用罗丹明123自发荧光测定方法测定细胞内罗丹明123的蓄积，考察DLJ14对P-gp外排泵功能的影响；采用荧光素.荧光素酶法分析K562/A02及K562细胞中ATP含量，考察DLJ14对P-gp能量依赖性的影响；采用无机磷释放法观察DLJ14对ATPase活性的影响；采用western blot法和Realtime-PCR法观察DLJ14对K562/A02细胞内P-gp的蛋白表达及其mRNA水平的影响。
　　 其次，考察化合物DLJ14对GST耐药途径的影响。利用GST和GPX可以催化GSH与1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)生成带颜色的化合物，用紫外分光光度计测定其吸光度值检测细胞内GST、GPX活性及GSH水平。用western blot和Realtime-PCR法检测DLJ14对K562/A02及K562细胞GST蛋白表达及其mRNA水平的影响。同样采用western blot法检测DLJ14对两种细胞内c-jun氨基末端激酶(JNK)及其磷酸化形式(p-JNK)表达的影响。
　　 实验结果如下：
　　 一、川芎嗪芪类衍生物逆转耐药活性筛选
　　 K562/A02和K562细胞对阿霉素(Adr)的IC50分别是4.66±0.27μmol/L，0.035±0.009 umol/L，耐药倍数为133.3倍，具有稳定的耐药性；对24个川芎嗪芪类衍生物进行逆转多药耐药活性筛选，其中DLJ14、DLJ21及DLJ29表现出较好的逆转活性，20μmol/L浓度时逆转倍数分别为22.46，7.28及9.16。DLJ14对K562/A02及K562细胞的毒性作用均较弱，20μmol/L浓度作用120h对两种细胞的抑制率分别为27.20％，28.56％，而10μmol/L VP则为48.70％及41.70％。在测定阿霉素的蓄积实验中，未加药处理的K562/A02细胞中阿霉素的浓度仅为K562细胞的42.3％，而在加入DLJ14处理之后，两种细胞中的阿霉素蓄积均显著增加并呈现剂量依赖性。
　　 二、DLJ14对P-gp外排泵的逆转耐药机制研究
　　 对P-gp耐药途径的研究中，首先测定了细胞内罗丹明123的蓄积。在未加药处理之前，K562/A02细胞中罗丹明123的浓度仅为K562细胞的33.64％，而在加入具有逆转活性的DLJ14之后，K562/A02细胞中的罗丹明123蓄积显著增加并呈现剂量依赖性，而K562细胞中罗丹明123浓度无明显变化。通过无机磷释放法测定细胞中ATP酶活性，实验结果显示耐药株K562/A02细胞中ATPase活性高于敏感株K562细胞，10，20 umol/L DLJ14可以显著降低K562/A02细胞中的ATPase活性。而各浓度的DLJ14对K562中ATPase活性基本没有影响。另外，在通过荧光素-荧光素酶法测定细胞内ATP含量的实验中，DLJ14(2.5，5，10，20μmol/L)可不同程度地降低K562/A02细胞内ATP水平，但对K562细胞内ATP水平的影响程度较弱。Western blot结果显示，K562/A02细胞内P-gp有较强表达，而K562细胞内则无P-gp表达。DLJ14对K562/A02细胞中P-gp表达无明显影响。Realtime-PCR法检测P-gp mRNA水平，结果显示K562细胞中Mdr1基因mRNA表达水平远远低于K562/A02细胞，而高浓度剂量20μmol/L DLJ14可以少量降低Mdr1基因mRNA表达水平，其余低剂量DLJ14则无显著作用，其差异不具有统计学意义。
　　 三、DLJ14对GST相关通路的逆转耐药机制研究
　　 对GSTπ相关通路的逆转耐药机制的研究中，耐药株K562/A02细胞中的GST，GPX活性显著高于K562细胞。在经过5，10，20μmol/L DLJ14处理K562/A02细胞72h后，GST活性分别降低3.26％，11.57％及20.77％，而GPX活性分别降低18.80％，32.83％及42.61％，具有剂量依赖性。而K562/A02细胞内GSH水平低于K562细胞，经5，10，20μmol/L Did14处理后K562/A02细胞内GSH含量升高，分别增加4.86％，18.69％及31.59％。用Western blot方法测定GSTπ蛋白表达水平，DLJ14可以显著减少K562/A02及K562细胞中GST蛋白表达。同时用Realtime-PCR检测GST基因表达mRNA水平，经2.5μmol/LDLJ14处理K562/A02及K562细胞72h后，可显著降低细胞内GST基因mRNA水平，结果具有统计学差异。单用DLJ14(2.5，20μmol/L)处理K562/A02及K562细胞72h后，测定细胞内JNK及p-JNK表达，各组中JNK蛋白表达水平无明显差异，而20μmaol/L DLJ14可以略微增加p-JNK的表达。将DLJ14(2.5，20μmol/L)与Adr(10μmol/L)合用处理K562/A02及K562细胞72h后，测定其中的p-JNK表达，各组中p-JNK蛋白表达水平明显增加。
　　 本课题筛选出了具有良好逆转活性的川芎嗪芪类衍生物DLJ14，它可通过抑制P-gp功能和调节GSTπ相关通路增加阿霉素的细胞毒性作用，从而达到逆转多药耐药的目的。川芎嗪芪类衍生物DLJ14可能成为肿瘤多药耐药逆转剂之一，具有深入研究的价值。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

实验材料

一 药品及试剂

二 主要仪器

实验方法

1 细胞培养

2 川芎嗪芪类衍生物逆转耐药活性筛选

2.1 耐药倍数测定实验

2.2 川芎嗪芪类衍生物逆转耐药活性初步筛选

2.3 DLJ14对细胞生长的抑制作用

2.4 DLJ14耐药逆转倍数测定实验

2.5 阿霉素胞内蓄积实验[37]

3 DLJ14对P-gp外排泵的逆转耐药机制研究

3.1 罗丹明123胞内蓄积实验

3.2 ATPase活性测定

3.3 细胞内ATP含量的测定

3.4 Western blot实验

3.5 Realtime-PCR实验

4 DLJ14对GST相关通路的逆转耐药机制研究

4.1 GST相关酶活性及GSH含量的测定实验

4.2 western blot法测定GSTπ蛋白表达

4.3 Realtime-PCR法测定GSTπ的mRNA水平

4.4 western blot法测定JNK及p-JNK蛋白表达

5 数据处理

实验结果

1 川芎嗪芪类衍生物活性筛选

1.1 K562/A02耐药株耐药性检测

1.2 川芎嗪芪类衍生物逆转K562/A02细胞内MDR活性测定

1.3 DLJI4对肿瘤细胞生长抑制作用

1.4 DLJ14对K562/A02细胞耐阿霉素的逆转倍数

1.5 DLJ14增加肿瘸细胞内Adr的浓度

2 DLJ14对P-gp外排泵的逆转耐药机制研究

2.1 DLJ14增加K562/A02细胞内Rh123的蓄积

2.2 DLJ14抑制K562/A02细胞内ATPase活性

2.3 DLJ14降低细胞内ATP的含量

2.4 DLJ14对细胞内P-gp表达的影响

2.5 DLJ14对细胞内Mdr1 mRNA表达的影响

3 DLJ14对GSTπ相关通路的逆转耐药机制研究

3.1 DLJ14抑制K562/A02细胞内GST相关酶的活性

3.2 DLJ14提高K562/A02细胞内GSH含量

3.3 DLJ14抑制细胞内GSTπ的蛋白表达

3.4 DLJ14降低肿瘤细胞GSTπ mRNA水平

3.5 DLJ14对细胞内JNK及p-JNK表达的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位论文期间发表的论文

Connexin 43,a new therapentic target for cardiovascular diseases

学位论文评阅及答辩情况表