驱动蛋白KIF4对胃癌细胞BGC增殖和卵巢癌细胞SK-OV-3迁移的影响

摘要

研究目的：
　　 研究驱动蛋白KIF4在胃癌组织的表达情况及对胃癌细胞BGC增殖的影响。同时研究KIF4对卵巢癌细胞SK-OV-3迁移的影响。为阐明KIF4在肿瘤发生发展中的作用奠定基础，同时也为探索新的肿瘤生物治疗方法提供帮助
　　 一、驱动蛋白KIF4在胃癌组织中的表达情况
　　 1、免疫组织化学染色实验比较KIF4在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况
　　 本研究中23例原发性胃癌病人于2006-2008年间在山东大学齐鲁医院接受外科手术，手术之后，肿瘤样本和它相应的癌旁组织用石蜡包埋，室温储存。石蜡包埋的标本组织被切成4-5um，放置至载玻片上。羊血清封闭后，抗KIF4的多克隆抗体以1:500稀释，加至载玻片上。免疫染色用晶美生物技术公司的Histostain-Plus试剂盒，过程参照说明书。阴性对照用PBS溶液代替一抗。每张标本用奥林帕斯IX81倒置显微镜随机拍取5张照片。照片的累积光密度用Image-Pro Plus6.0软件进行分析。
　　 2、统计分析KIF4的表达量与临床资料的相关性
　　 用SPSSll.0进行统计学数据分析。每一个实验的结果用平均值±标准差来描述。用双侧t检验来比较实验组和对照组。用列联表来分析KIF4的表达与胃癌病人的病理学变量的关系。
　　 二、驱动蛋白KIF4对胃癌细胞BGC增殖的影响
　　 1、筛选稳定表达GFP-KIF4的BGC细胞株(BGC-GFP-KIF4)及稳定表达GFP的BGC细胞株(BGC-GFP)
　　 2、免疫荧光染色显示过表达KIF4引起的细胞多核性
　　 生长在盖玻片上的稳筛细胞株用冷甲醇室温固定5min，然后用含5％羊血清、0.3％TritonX-100的PBS封闭。一抗用鼠抗Tubulin的抗体（1：10000稀释），二抗用TexasRed交联的羊抗鼠的抗体（1:10000稀释），分别染色2h。DNA用DAPI(1ug/ml)染色5min。PBS洗后，用FluoroGuard抗淬灭剂将盖玻片固定在干净的载玻片上，指甲油封边。
　　 3、细胞增殖计数及MTT检测过表达KIF4对BGC增殖的影响
　　 将两种稳筛细胞株接种于24孔板中，每孔500u1细胞悬液中含5000个细胞，置培养箱中培养。在接下来的9天内，每隔一天计数细胞数量。根据数据给制细胞生长曲线。
　　 将两种稳筛细胞株接种于96孔板中，每孔200u1细胞悬液中含5000个细胞，置培养箱中培养。在接下来的9天内，每隔一天采用MTT法检测细胞增殖情况。每孔加入20ul5mg/mlMTT，继续培养4个小时。然后去除细胞培养基，加入20.0ulDMSO，20min后，在酶标仪上570nm测量吸光度值。根据数据绘制曲线。
　　 4、克隆形成实验检测过表达KIF4对BGC增殖的影响
　　 在35mm平皿中铺入2ml含0.6％琼脂的培养基，室温下凝固作为下层胶。1×104个细胞加入lml含0.3％琼脂的培养基中，作为上层胶。培养3周后，用0.05％结晶紫染色细胞30min。拍摄照片并用Image-Pro Plus6.0进行克隆计数。
　　 5、裸鼠体内成瘤检测过表达KIF4对BGC成瘤性的影响
　　 实验用的雌性BABL/c小鼠（6-8周大）从中国科学院上海实验动物中心购进。取4x106个BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP细胞和100 gMatrigel接种到无胸腺小鼠(nu/nu)的左腋下。每组5只。肿瘤的大小每周用游标卡尺进行测量。肿瘤的体积通过下列公式计算：体积=（长×宽2）/2。7周后，脱颈法处死小鼠，从小鼠体内取出肿瘤组织测量体积和称重并照相。
　　 6、统计分析
　　 使用SPSSI6.0软件进行统计学分析。对正态分布的配对数据进行，检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 三、驱动蛋白KIF4对卵巢癌SK-OV-3迁移能力的影响
　　 1.筛选稳定低表达KIF4的SK-OV-3细胞株
　　 2、低表达KIF4对卵巢癌细胞SK-OV-3迁移能力的影响
　　 使用SPSS16.0软件进行统计学分析。对正态分布的配对数据进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 一、驱动蛋白KIF4在胃癌组织中的表达情况
　　 1、驱动蛋白KIF4在胃癌中表达降低
　　 免疫组织化学检测了23例胃癌样本及相应的癌旁组织。KIF4的表达水平根据免疫组化染色实验分成8级。结果显示，23例中有13(56.5％)例呈现癌组织比癌旁组织低表达。应用Image-Pro Plus6.0软件，测量样本KIF4染色的累积光密度，发现所有癌旁组织的累积光密度比癌组织要高4倍。
　　 2、KIF4在胃癌组织中表达降低与胃癌分化有相关性
　　 我们接下来研究KIF4的表达和临床病理特征，临床档案资料之间的联系。结果显示KIF4的低表达和胃癌的低分化之间有显著相关性。在19例低分化的胃癌中，13例呈现出KIF4在癌组织中较癌旁组织中低表达。但是，4例中分化的肿瘤样本中，没有一例癌组织比癌旁组织KIF4低表达。所有结果表明，驱动蛋白KIF4在胃癌组织中低表达，且表达程度与肿瘤分化级别密切相关。
　　 二、驱动蛋白KIF4对胃癌细胞BGC增殖的影响
　　 1、成功筛选稳定表达GFP-KIF4的BGC细胞株(BGC-GFP-KIF4)及稳定表达GFP的BGC细胞株(BGC-GFP)
　　 2、免疫荧光染色显示过表达KIF4引起细胞多核性
　　 在BGC-GFP-KIF4细胞中存在比BGC-GFP细胞中更多的多核细胞。在BGC-GFP-KIF4细胞中有14.54±0.82％的多核细胞，而在BGC-GFP中只有4.44±0.46％，与BGC细胞中相似。
　　 3、细胞增殖计数及MTT表明过表达KIF4对BGC增殖有抑制作用
　　 细胞增殖计数及MTT每隔一天检测一次，一共持续9天。结果显示，前3天内，两株细胞间没有显著的差别。但是从第5天开始，BGC-GFP-KIF4相对于BGC-GFP和BGC细胞来说，增殖显著抑制。而在BGC-GFP和BGC之间没有增殖效率的不同，说明在BGC细胞表达GFP不会影响细胞的增殖。
　　 4、克隆形成实验表明过表达KIF4对BGC增殖有抑制作用
　　 为了检验细胞在不贴壁情况下的生存能力，利用软琼脂克隆形成实验来检测两种细胞系。1x104个细胞种植在35mm的软琼脂培养基中。3周后，细胞用结晶紫染色后拍照。计数细胞克隆。在BGC-GFP中有平均143±9个细胞克隆，而在BGC-GFP-KIF4中只有30±9个细胞克隆。这些结果说明在细胞不贴壁的情况下，当在BGC中过表达KIF4，细胞增殖被显著抑制。
　　 5、裸鼠体内成瘤表明过表达KIF4对BGC成瘤性的抑制作用
　　 4x106个BGC-GFP-KIF4或BGC-GFP细胞接种到无胸腺裸鼠的左腋下（每组5只），每周测量记录肿瘤大小，测量7周。由BGC-GFP-KIF4衍生出的肿瘤比BGC-GFP衍生出的生长缓慢很多。7周后，所有小鼠处死，分离肿瘤。然后将肿瘤样本称重并拍照。BG-GFP-KIF4生长出的肿瘤的平均重量(0.9±0.24g)显著低于BGC-GFP生长出的肿瘤(3.0-1.17g)，大约要轻3倍。这些结果都表明，BGC-GFP-KIF4在裸鼠形成肿瘤的能力相对于BGC-GFP来说要弱很多。表明在BGC细胞过表达KIF4可抑制体内肿瘤的形成。
　　 三、驱动蛋白KIF4对卵巢癌SK-OV-3迁移能力的影响
　　 1、筛选稳定低表达KIF4的SK-OV-3细胞株
　　 2、细胞迁移实验
　　 SK-OV-3组、NC对照组、KIF4敲除组l、KIF4敲除组2下室面细胞平均数分别为122、112、298、312。KIF4敲除组迁移到下室面的细胞数明显多于SK-OV-3组和NC对照组，可达大约3倍。
　　 结论及意义：
　　 1.本研究成功构建了一个过表达质粒pEGFP-KIF4和两个敲除质粒pGPU6/GFP/Neo-KIF4及pGPU6/GFP/Neo-NC，三种载体的构建为进一步研究KIF4的功能提供了必要的条件。
　　 2.本研究表明驱动蛋白KIF4在胃癌中表达降低，且与胃癌分化有相关性。为胃癌发病机制的研究奠定了基础，也为下一步的细胞水平实验指明了方向。
　　 3.本研究证明在胃癌细胞BGC中过表达KIF4可抑制BGC的增殖和体内成瘤，为进一步深入研究KIF4功能奠定了基础，同时也为发现胃癌治疗新靶点提供实验依据。
　　 4.本研究证明在SK-OV-3中低表达KIF4可使细胞迁移能力增强，为进一步研究KIF4在细胞迁移中的作用奠定了基础。

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方法

结果

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第二部分

技术路线

材料

方法

结果

讨论

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参考文献

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