新型蛋白酶体抑制剂地钱素M诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的研究

摘要

前列腺癌(prostate cancer，PCa)作为常见的男性恶性肿瘤，在我国的发病率较欧美国家低，但近年来呈明显的增长趋势，且中晚期患者的比例远远大于国外，由于PCa潜伏期长，发病机制复杂，尚无有效的治疗手段，因此，PCa的预防与治疗一直备受关注。目前激素撤除治疗是中晚期前列腺癌的首选方法，通过手术、抗雄激素类药物的激素阻断治疗，对约80％的前列腺癌有效。然而绝大多数肿瘤经治疗后，PCa发展为激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer,HRPC)，对抗内分泌治疗，预后差，死亡率高。PCa由激素治疗敏感到耐受的演变是复杂的多因素、多信号途径参与的过程[1,2].
　　 尽管对HRPC的病理机制有相当深入的研究，至今临床无有效的治疗方案，化疗依然是主要的治疗手段。针对雄激素受体途径、抗凋亡基因、血管生成因子、生长因子受体、信号通路蛋白等靶点的各种化学药物、疫苗、单克隆抗体等均能有效抑制前列腺癌细胞增殖，诱导其凋亡，显示出良好的效果[3-5]。如多西紫杉醇常用于晚期HRPC的治疗，通过稳定微管、诱导凋亡而发挥作用，是唯一被证实可明显延长HRPC患者生存期的药物，使HRPC的化疗取得了新的进展，同时也显示出天然产物作为抗肿瘤药物的巨大潜力。因此，研究HRPC的发病机制、探索新的治疗靶点及方法，是预防与治疗HRPC的有效策略。
　　 泛素-蛋白酶体(ubiquitin-proteasome system，ups)是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，能够精确降解细胞内各种靶蛋白，对于细胞周期运转、细胞分化与凋亡、免疫应答、信号转导等生理过程起着重要的调控作用。对恶性肿瘤细胞而言，蛋白代谢紊乱，UPS调节失衡，使UPS与肿瘤的发生发展、多药耐药、免疫监控逃逸等病理过程密切相关。而抑制UPS对肿瘤细胞比正常细胞更为敏感，可导致细胞周期阻滞、细胞凋亡等。因此UPS成为肿瘤治疗的新靶点，蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors)也成为一种非常有前景的抗肿瘤药物[6,7]。因此，发现新的蛋白酶体抑制剂为抗肿瘤药物的研究提供了新思路，而天然产物以其独特的结构类型更是受到研究者的青睐[8]。
　　 苔藓植物作为从水生到陆生过渡的一类高等植物，品种繁多，抗虫害、抗腐烂等独特的生物特性导致其化学成分结构多样，包括萜类化合物、酚类化合物和联苄类化合物等[9-15]，是发现药效活性分子的宝贵资源。双联苄类化合物作为苔藓植物的成分之一，是新型植物抗生素，具有广泛的生理活性，具有抗菌、抗病毒、细胞毒等活性。我们通过对50多种联苄类化合物进行抗肿瘤活性筛选，发现其中一些化合物具有很好的抑制肿瘤细胞增殖活性。双联苄化合物地钱素M(Marchantin M，Mar)具有抑制肿瘤细胞增殖活性，且对前列腺肿瘤细胞的抑瘤活性显著。本文就双联苄化合物地钱素M抑制激素非依赖性前列腺癌PC3细胞增殖的机制进行了初步探索。
　　 首先通过细胞增殖实验检测地钱素M的抑瘤活性，结果显示地钱素M对人肝癌HepG2细胞的抑制作用较弱，对人白血病K562细胞和腺体瘤包括人乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌LNCaP、DU145和PC3细胞抑制作用比较明显，特别是对激素非依赖性前列腺癌PC3细胞的增殖抑制作用尤为显著，而地钱素M对正常人视网膜上皮细胞hTERT-RPE1细胞毒性作用较小，表明肿瘤细胞对地钱素M更为敏感。BrdU掺入实验表明，地钱素M以浓度依赖的方式显著抑制PC3细胞的增殖活性。流式细胞术分析结果显示，地钱素M阻滞PC3细胞于G0/G1期。分析G0/GI期周期相关蛋白的表达，结果显示，地钱素M诱导周期蛋白激酶抑制蛋白p21 cip1的表达，抑制CyclinD1的表达，同时使Rb蛋白的磷酸化程度降低，抑制细胞周期G1/S期的转变。另外，流式细胞术分析结果出现显著的亚二倍体峰，提示地钱素M抑制细胞增殖可能与诱导细胞凋亡有关。进一步研究发现，经地钱素M处理后的PC3细胞的形态发生显著变化，Giemsa染色和PI/Hoechest33342双染结果显示，细胞变圆，脱落明显，且细胞形态出现凋亡细胞的特征性改变，DAPI染色观察到细胞核发生明显的凋亡性变化。Westernblotting结果显示，地钱素M处理后，PC3细胞内的抗凋亡蛋白Bcl2的表达下调，而促凋亡蛋白Bax的表达明显增高，其Bax/BeL2的比率显著增加。由于Caspase在细胞凋亡中发挥重要作用，我们的检测结果表明，地钱素M能够激活PC3细胞中Caspase3活性，促进多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的剪切，说明地钱素M可能以Caspase依赖的方式诱导PC3细胞凋亡。而经地钱素M处理后，细胞内Caspase9和Caspase4的活性增加，但Caspase8活性并无明显改变，表明线粒体、内质网途径可能参与地钱素M诱导PC3细胞凋亡的作用，但其机制仍需进一步研究。由于地钱素M与荼多酚的结构相似，后者已被证实具有抑制蛋白酶体的作用，因而我们检测地钱素M对蛋白酶体的酶解活性的影响。检测结果显示，地钱素M在体外显著抑制纯化的20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性、多肽/谷氨酰水解酶活性，其抑制作用随浓度的增加而增强。而经地钱素M作用后PC3细胞内糜蛋白酶样活性、多肽/谷氨酰水解酶活性随着地钱素M作用浓度的增加、作用时间的延长而显著降低，表明地钱素M具有明显的抑制蛋白酶体活性的作用。因此，地钱素M可能是通过抑制蛋白酶体活性发挥了诱导PC3细胞凋亡的作用。
　　 总之，本研究结果表明，双联苄类化合物地钱素M具有抑制激素非依赖性前列腺癌PC3细胞增殖、引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡的作用。其作用机制可能是通过抑制蛋白酶体活性诱导细胞凋亡，线粒体和内质网可能参与其诱导凋亡的过程。本研究首次报道一种新型的蛋白酶体抑制剂，为天然的双联苄化合物的进一步开发利用提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

缩写表

前言

一 前列腺癌的发病机制与治疗现状

二 蛋白酶体抑制与肿瘤的关系

三 细胞凋亡与难治性前列腺癌

四 地钱素M的抗肿瘤活性与蛋白酶体抑制作用

实验材料和方法

一 实验仪器

二 实验材料与试剂

三 实验方法

实验结果

讨论

结论

论文的不足之处

参考文献

致谢

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