轴突导向分子EphA5诱导中脑神经上皮干细胞向纹状体投射的实验研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease)是老年人常见的神经遇行性疾病，该病的主要病理学特征是中脑内多巴胺能（Dopaminergic，DA）神经元的选择性退变，导致纹状体内多巴胺含量降低，纹状体的神经元失去了多巴胺神经递质的调节作用，从而引起震颤麻痹等锥体外系运动障碍。随着我国老龄社会的来临，该病的发病率逐年升高，严重影响病人的生活质量，并给家庭及社会带来沉重负担，探求帕金森病的致病机制进而寻找有效治疗办法是社会的迫切需求。
　　 研究帕金森病的核心问题就是阐明该病的发病机理，从而实现针对性防治。多年的研究表明，遗传及环境多种因素均与帕金森病有关，国内外学者提出了遗传因素学说、氧化应激学说及铁代谢学说等，上述不同致病因素均是引发中脑多巴胺能神经元的选择性退变而导致帕金森病的。中脑多巴胺神经元及其向纹状体靶向投射的异常是导致帕金森病的神经解剖学基础，也是研究帕金森病最本质的问题。
　　 新近有研究指出，轴突导向分子EphA5可能与中脑DA神经元轴突的靶向生长相关；免疫组织化学染色也显示，中脑DA神经元大都同时表达酪氨酸羟化酶(TH)和EphA5。作为轴突导向分子的EphA5与纹状体细胞表达的EphA5配体的结合可能是DA神经元轴突向纹状体生长的重要机制。基于这种理念，我们设计了这一实验：
　　 (1)以中脑神经上皮干细胞为研究对象，应用免疫细胞化学染色、RT-PCR及Western-blot等技术方法检测了EphA5在中脑神经上皮干细胞中的表达状况和其配体Ephrin-A5在纹状体中的表达状况；
　　 (2)为进一步检测EphA5是否引导了中脑DA神经元轴突向纹状体的投射，我们在新生鼠脑纹状体部注入绿色荧光示踪剂，逆行标记了中脑中向纹状体投射的那部分DA神经元；同时应用免疫细胞化学染色检测了中脑中绿色荧光阳性神经元同时表达EphA5的状况，以明确这些逆行标记的阳性DA神经元就是EphA5阳性细胞；
　　 (3)将取自GFP转基因鼠的中脑神经上皮干细胞与普通鼠的纹状体组织块联合培养，观察了细胞向纹状体的靶向生长情况；并检测了纹状体提取液对中脑神经上皮干细胞轴突生长的作用；
　　 (4)应用RNA干扰技术，沉默基因EphA5的表达，观察干扰后的中脑神经上皮干细胞的轴突生长情况。
　　 (1)取自胚胎中脑的神经上皮干细胞，培养24h后，细胞贴壁并发出短的突起；48h后，免疫荧光染色显示，绝大多数细胞呈TH阳性，其中部分细胞呈EphA5阳性；
　　 (2)鼠脑纹状体区EphA5免疫荧光染色显示，纹状体部的大多数细胞呈Ephrin-A5阳性，说明这些细胞是产生EphA5配体的细胞；
　　 (3)RT-PCR及Western-blotting检测结果显示，纹状体组织Ephrin-A5mRNA及蛋白的表达水平均高于对照组前额叶皮质，结果有显著性差异(P<0.01)；进一步证明了EphA5的配体来自绞状体细胞；
　　 (4)纹状体绿色荧光逆行示踪和TH、EphA5免疫荧光染色结果显示，荧光标记的神经元大部呈TH阳性，部分呈EphA5阳性，说明DA神经元大部分投射至纹状体，其中部分细胞表达EphA5;
　　 (5)将中脑神经上皮干细胞与纹状体组织块联合培养，结果显示，培养l2h后，有些细胞在靠近纹状体组织块一侧出现丘状隆起；24h后，细胞伸出短突起：48h后，突起增多伸长；培养3d后，可见细胞在靠近纹状体的一侧伸出长的线性突起而在其它方向突起短。应用取自GFP转基因鼠的中脑神经上皮干细胞与普通鼠的纹状体组织块共培养，朝向纹状体组织块生长的突起数目及长度明显大于背向生长情况（P　　 (6) RNA干扰后的中脑神经上皮干细胞与纹状体组织块联合培养结果显示，突起向纹状体汇集的趋势不明显，朝向和背向纹状体组织块伸出的突起数目、长度无统计学差异(P>0.05)。
　　 本项研究表明，中脑神经上皮干细胞表达轴突导向分子EphA5，其配体Ephrin-A5在纹状体中呈阳性表达，EphA5可诱导中脑神经上皮干细胞向纹状体的神经投射。

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