棉铃虫Hsp90、胸腺素和丝氨酸蛋白酶抑制因子在发育中的表达模式与激素调控

摘要

蜕皮和变态是全变态昆虫生长发育过程中重要的生物学过程，受到多种激素的调节，其中由前胸腺分泌的蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮，20E)发挥了重要作用。由蜕皮激素受体复合物EcR/USP介导的20E信号通路调控了蜕皮和变态相关基因的表达，最终控制蜕皮和变态的生理反应。在蜕皮与变态期，一些先天免疫相关基因也受到20E的调控。本文以农业害虫棉铃虫为实验材料，研究三个在变态时期高表达的基因：Hsp90、胸腺素（包括两个转录异构体）和丝氨酸蛋白酶抑制因子在个体发育中的表达模式和激素调控。
　　 1.棉铃虫Hsp90
　　 为了研究进化上高度保守的Hsp90在昆虫激素信号途径中的作用，我们从棉铃虫中克隆得到了热休克蛋白90的全长cDNA，长2422 bp，编码717个氨基酸，含有一个组蛋白激酶样的ATP酶结构域。BLAST分析显示，HaHsp90与草地贪夜蛾的Hsp83相似性高达99％，命名为HaHsp90。Northern blot分析结果发现hsp90在6龄72h的表皮、6龄120h的中肠和6龄96h的血细胞等变态时期高表达。在中肠中其表达水平同时受蜕皮激素和保幼激素上调。RNAi结果显示，干扰EcR、USP和Met对Hsp90的表达没有影响，而干扰Hsp90后，USP、HHR3、E75和Met的表达下调；体内外结合实验显示Hsp90与USP1相互作用。所有结果表明Hsp90通过结合USP1来调控关键转录因子的表达，从而参与20E信号途径。另外，Hsp90也可能参与JH信号通路。
　　 2.棉铃虫胸腺素
　　 胸腺素的研究主要集中在脊椎动物，为了研究胸腺素在昆虫中的作用，我们从棉铃虫克隆得到胸腺素基因的两个cDNA序列，命名为HaTHYI和HaTHY2，开放阅读框分别为510 bp和396 bp，编码的蛋白理论分子量分别为19 kDa和14.5 kDa。序列比对发现HaTHY2与HaTHY1相比仅仅缺失了一段。基因组序列发现HaTHYI和HaTHY2是来源于同一个基因的不同转录异构体。
　　 RT-PCR分析显示，HaTHYI主要在表皮和中肠中表达，HaTHY2主要在血细胞和变态时期脂肪体中表达。另外，HaTHY1受20E诱导上调，两者都受细菌刺激上调，而HaTHY2对病毒刺激反应比较显著。这些差异说明这两个异构体存在功能上的差异。
　　 3.棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制因子
　　 昆虫中丝氨酸蛋白酶抑制因子serpin的研究集中在酚氧化酶原激活途径中的丝氨酸蛋白酶及联反应，为了研究serpin在昆虫蜕皮激素级联反应中的作用，我们从棉铃虫中克隆得到了丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为HaSerpin，cDNA全长1441 bp，编码43.5 kDa的蛋白。进化上与蓓带夜蛾的serpin-1比较接近。
　　 RT-PCR分析显示，HaSerpin的mRNA在各组织变态时期表达量比较高，且表达水平受20E上调。这表明HaSerpin参与棉铃虫变态过程。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

PTTH

蜕皮激素

保幼激素

受蜕皮激素调控的先天免疫基因

第二章 棉铃虫Hsp90的基因克隆和性质研究

前言

材料和方法

1． 材料

2． 方法

结果

1． 棉铃虫热休克蛋白90 0taHsp90)的克隆

2． Hallsp90基因的鉴定

3． HaHsp90的发育阶段表达模式

4． 激素对HaHsp90表达水平的影响

5． Hsp90在表皮细胞系激素信号途径中的作用

6． HaHsp90重组表达与抗体制备

7． HaHsp90与HaUSPI的相互作用

讨论

第三章 棉铃虫HaTHY的基因克隆和性质研究

前言

材料和方法

1． 材料

2． 方法

结果

1． 基因克隆

2． HaTHYI和HaTHY2的鉴定

3． 基因组序列克隆

4． HaTHYI和HaTHY2的表达模式

5． 激素调控

6． 免疫刺激对胸腺素表达的影响

讨论

第四章 棉铃虫HaSerpin的基因克隆和性质研究

前言

材料和方法

1． 材料

2． 方法

结果

1． HaSerpin基因克隆

2． HaSerpin的鉴定

3． HaSerpin在各组织发育阶段的表达模式

4． ltaSerpin的激素调控

5． 重组表达和抗体制备

讨论

论文创新点总结及讨论

参考文献

致谢

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