脂联素与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系及影响脯氨酰4-羟化酶表达的机制

摘要

本研究分为两部分：
　　 第一部分：脂联素对P4Hα1表达作用及对动脉粥样硬化斑块稳定性关系的研究
　　 研究目的：
　　 1.观察脂联素与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系。
　　 2.观察脂联素与动脉粥样硬化斑块中胶原合成酶P4Hαl及胶原变化的关系。
　　 材料和方法：
　　 1.动物模型建立：
　　 120只12周龄，25_30g的雄性apoE小鼠实验全程高脂饮食(含0.25％胆固醇和15％脂肪)喂养。
　　 颈动脉套管和基因转染：通过左总颈动脉套管的方法构建动脉粥样硬化斑块动物模型。套管6周后，120只老鼠随机分为PBS组，空病毒转染组和脂联素腺病毒转染组，每组40只。PBS组的apoE小鼠尾静脉注射0.1mlPBS，空病毒组的apoE小鼠尾静脉注射含2×10。pfu的0.1 ml的绿色荧光蛋白腺病毒载体悬液，脂联素腺病毒转染组的apoE小鼠尾静脉注射含2×108 pfu的O.1ml的脂联素腺病毒载体悬液。
　　 2.显微超声检测：
　　 使用显微超声影像系统Vev0770于转染前探测未套管侧和左套管侧颈总动脉动脉粥样硬化斑块的基线超声参数。
　　 3.血液生化指标检测：
　　 转染前和处死前分别取血检测血糖，血胰岛素，总胆固醇，高密度脂蛋白，甘油三酯，低密度脂蛋白和血浆脂联素水平。
　　 4.病理学检测：
　　 颈动脉斑块组织学切片分别行苏木素-伊红染色、天狼猩红染色、油红O染色、Pcrl's染色，并进行免疫组织化学染色观察巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、P4Hαl、胶原I和Ⅲ的局部表达。使用图像分析软件(Image-Pro Plus5.0 soitware)测量斑块面积、纤维帽面积、脂质核面积、纤维帽厚度和内中膜厚度。斑块形态学分级：结合染色结果，根据Virmanis classificationcriteria，将斑块进行分级。①纤维样病变，②粥样瘤，③薄纤维帽的纤维粥样瘤，④破裂后愈合，⑤破裂或斑块内出血，⑥斑块糜烂。其中1级、2级认为是稳定斑块，3～6级认为是不稳定斑块。
　　 5.实时定量RT-PCR：
　　 实时荧光定量RT-PCR反应检测斑块内P4Hal mRNA的表达水平。
　　 6.免疫印迹(Westenr blot)检测：
　　 免疫印迹(Westenrblot)检测斑块内P4Hal，胶原I和胶原Ⅲ的蛋白质水平。
　　 结论：
　　 1.脂联素过表达能显著增加动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞及胶原的表达，平均纤维帽厚度、纤维帽面积和帽.核比值明显增加，同时动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞和脂质的含量显著降低，从而使动脉粥样硬化斑块纤维帽增厚，易损性降低，稳定性显著增加。
　　 2.脂联素过表达能显著增加动脉粥样硬化斑块P4Hα1表达，从而导致动脉粥样硬化斑块内胶原含量明显增加，斑块纤维帽增厚，斑块稳定性增加。
　　 第二部分：脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用及信号传导通路
　　 研究目的：
　　 1.明确脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用；
　　 2.明确脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中ERKl/2的作用；
　　 3.明确脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中转录因子Spl的作用。
　　 研究方法：
　　 1.平滑肌细胞的培养：
　　 人主动脉平滑肌细胞(HASMCs,human aortic smooth muscle cells)购自CELLSCIENCE公司，使用CELLSCIENCE公司的平滑肌培养基，在37℃和5％C02孵育箱中进行培养。前4代细胞冻存于液氮罐中保存，5-8代细胞行细胞试验。细胞在37℃，5％C02孵箱中培养至80％-90％融合，刺激前无血清饥饿培养至少24小时。
　　 2.实验分组
　　 2.1根据IL-6的不同作用时间及不同浓度梯度分组
　　 为了观察不同作用时间及不同浓度梯度IL-6刺激平滑肌细胞P4Hal表达的变化，按照IL-6的作用浓度分为5个组：平滑肌细胞空白对照组，10ng/ml IL-6处理组，20ng/ml IL-6处理组，50ng/ml IL-6处理组，100ng/ml IL-6处理组。根据IL-6不同作用时间分为5个组：平滑肌细胞空白对照组，IL-6处理6d'时组，IL-6处理12d,时组，IL.6处理24d,时组，IL-6处理48d,时组。处理后收集细胞，应用RT-PCR和蛋白印迹方法分别检测P4Hαl的mRNA和蛋白质水平的变化。
　　 2.2根据脂联素的不同作用时间及不同浓度梯度分组
　　 为了观察不同作用时间及不同浓度梯度脂联素刺激情况下IL-6介导的平滑肌细胞P4Hal表达的变化，按照脂联素的作用浓度分为8个组：平滑肌细胞空白对照组，平滑肌细胞+20ng/ml IL-6对照组，平滑肌细胞+Ad.Empty对照组，5MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组，10MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组，20MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组，50MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组，100MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组。根据脂联素不同作用时间分为7个组：平滑肌细胞空白对照组，平滑肌细胞+20ng/ml IL-6对照组，平滑肌细胞+Ad.Empty对照组， Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理4小时组，Ad.Adipo+20ng/mlIL-6处理8小时组，Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理12小时组，Ad.Adipo+20ng/mlIL-6处理24小时组。处理后收集细胞，应用RT-PCR和蛋白印迹方法分别检测P4Hal的mRNA和蛋白质水平的变化。
　　 2.3脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中Spl的作用
　　 实验分组
　　 1)静态组：不给予任何处理，观察Spl的DNA结合活性，Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hal rnRNA表达及其蛋白质水平的变化；
　　 2)WP631组：只给予0.1 laM Spl抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时，观察Spl的DNA结合活性，Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；
　　 3)脂联素组：以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时，观察Spl的DNA结合活性，Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；
　　 4)WP63l+脂联素组：给予0.1μM Spl抑制剂WP63l刺激平滑肌细胞1小时，再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时，观察Spl的DNA结合活性，Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hal mRNA表达及其蛋白质水平的变化；
　　 5)IL-6组：以20ng/ml的IL-6刺激平滑肌细胞0min，15min,30min,1小时，2小时，24小时，观察Spl的DNA结合活性，Spl的亚细胞分布的变化以及P4HalmRNA表达及其蛋白质水平的变化：
　　 结论：
　　 1.炎症因子IL-6可显著抑制平滑肌细胞P4Hα1表达，脂联素作为具有抗炎活性的脂肪细胞源性血浆蛋白可显著上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达；
　　 2.在脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中,Sp1作为重要的转录因子参与了P4Hα1表达的调节：
　　 3.在脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞Spl/P4Hα1信号转导通路过程中，ERK1/2参与了P4Hα1表达的调节。
　　 总之，脂联素可以通过Sp1/ERK1/2-MAPKs/P4Hα1信号途径上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达。

目录

CONTENTS

论文Ⅰ脂联素对P4Hα1表达作用及与对动脉粥样硬化斑块稳定性关系的研究

符号说明

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

论文Ⅱ脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用及信号传导通路

符号说明

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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