高同型半胱氨酸血症与慢性肾脏病患者心脑血管疾病的关系研究

摘要

背景：
　　 同型半胱氨酸(Homocysteinemia，Hcy)是人体内蛋氨酸代谢的中间产物，各种原因导致的血液中总Hcy(total Hcy，tHcy)的浓度病理性升高称为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHC)[1]。很多因素可引起血浆tHcy升高，如叶酸、维生素B缺乏、各种原因导致的肾脏损伤及服用药物等。大量流行病学资料发现，HHC是人群心脑血管疾病发病的独立危险因子[1-7]。慢性肾脏病(chronickidney disease，CKD)是导致高同型半胱氨酸血症的重要原因之一，当患者肾功能水平逐渐减退至终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)需要透析治疗时，超过90％的患者同时伴有中等水平的高同型半胱氨酸血症(>15μmol/L)[8]，而心脑血管病变是CKD患者的重要并发症。Moustapha等[9]研究发现，血浆tHcy水平升高与ESRD患者心、脑血管病变发病率升高有关，血浆tHcy浓度每增加1μmol/L，CVD相对危险性增加1％。但Wald等人[10]进行的一项荟萃分析显示tHcy每增高5μmol/L，心血管事件的危险率增高32％，脑卒中风险升高59％。按此推理，在CKD患者中高同型半胱氨酸血症发生率如此之高，心脑血管事件的危险性会出现成倍增加，而事实并非如此。所以，CKD患者的HHC是否是其高心脑血管病变发生率的危险因素以及其作用机制目前尚有争议。
　　 血细胞来源的组织因子(TF)在病理性血栓中的作用已有广泛的研究。其中Mo TF与动脉粥样硬化的发生与发展及血栓形成有密切的关系[11，12]。新近发现，AMI及不稳定性心绞痛患者外周血中Mo TF的表达明显高于稳定性心绞痛的患者，AMI发作后的持续性高凝状态与Mo的TF表达增高有关[13]。而AIS患者凝血、抗凝及纤溶活性改变在血栓形成的发病过程中亦具有重要意义[14-16]。其TF在血管内不恰当地表达引起血栓形成会导致致死性的栓塞。MoTF受多种因素影响，有报道表明Hcy能通过诱导血管内皮细胞TF的表达改变机体凝血和抗凝机制[17]，那么Hcy能否通过诱导单核细胞TF基因表达的上调从而导致CKD患者急性心脑血管血栓性疾病发病率增高，以及其诱导TF基因和蛋白表达的机制如何，迄今未见此类报道。我们进行了一系列临床病例采集和实验室研究，探讨Hcy在CKD患者心脑血管病变发生中的地位及其具体作用机制。
　　 第一部分
　　 目的：观察慢性肾脏病(CKD)患者血浆总同型半胱氨酸(tHcy)水平与动脉粥样硬化及心脑血管病变的关系。
　　 方法：取健康对照35例、慢性肾脏病患者90例(维持性血液透析患者50例)作为受试者，评估受试者心脑血管病变情况，检测受试者各项生化指标及血液指标，以高效液相色谱法测定受试者血浆tHcy水平，采用彩色多普勒超声检查受试者颈动脉内一中膜层厚度(IMT)及粥样斑块的情况，评估CKD患者心脑血管病变发生情况，采取分组对照及相关分析和多元逐步Logistic回归分析评价tHcy及各项指标与CKD患者心、脑血管疾病的关系。
　　 结果：1)CKD组中84.4％(76/90)的患者存在HHC(tHcy>15μmol/L)，且CKD组血浆tHcy浓度显著高于对照组(P<0.05)；CKD患者中，73例合并心、脑血管病变者血浆tHcy浓度显著高于无心、脑血管病变者(P<0.01)。
　　 2)CKD组颈动脉IMT，斑块阳性率显著高于对照组(P<0.05)。CKD高tHcy组(tHcy>15μmol/L)颈动脉IMT，斑块阳性率及心脑血管病变发生率显著高于CKD正常tHcy组(P<0.05)；
　　 3)受试者血浆tHcy水平与IMT、斑块阳性率呈正相关关系(P<0.05)血浆tHcy、TG、Hb是CKD患者并发心、脑血管病的危险因素(r分别为0.351，0.712，0.199，P均<0.05)；
　　 结论：1)CKD患者存在HHC，且合并心、脑血管病变者血浆tHcy浓度显著增高；2)CKD患者颈动脉粥样硬化及心脑血管发生率高于正常人群，且与血浆tHcy水平有关联；3)血浆tHcy水平是CKD患者动脉粥样硬化及并发心、脑血管病的危险因素。
　　 第二部分
　　 目的：观察CKD患者并发急性心脑血管血栓性疾病时血浆tHcy水平及其与凝血启动因子之一--单核细胞组织因子的关系，从而进一步明确Hcy在CKD患者心脑血管并发症中的地位，探讨其可能的作用机制。
　　 方法：根据诊断学标准取CKD患者24例作为对照组，CKD患者中AMI患者10例，ASI患者9例，以高效液相色谱法测定各组受试者tHcy，以双夹心ELISA法测定血浆中TF抗原(TFAg)，以发色底物法检测单核细胞膜表面TF活性(TFact)，行组间对照研究，并应用相关分析和多元逐步Logistic回归分析评价tHcy、单核细胞组织因子及各项指标与心脑血管血栓性疾病的关系。
　　 结果：1)各组一般情况对照显示AMI组和AIS组CKD患者无论吸烟、饮酒史还是高血压、糖尿病、冠心病、脑梗发病率均高于对照组。AMI、AIS组血清肌酐及甘油三酯水平均显著高于对照组(P<0.05)，但两组间无差异，AMI组血清LDL-C显著高于对照组和AIS组(P<0.05)，而AIS组与对照组无差异。
　　 2)CKD患者中AMI及ASI组血浆tHcy水平均高于对照组(P<0.05)，而AMI组及AIS组间无显著差异。
　　 3)与对照组相比，AMI组与AIS组TF抗原均显著增加(P<0.05)，AMI患者血浆中TF活性增高，但无统计学意义(P>0.05)，AIS患者血浆中TF活性显著升高(P<0.05)。AIS组的血浆TF活性显著地高于AMI组(P<0.05)。
　　 4)CKD患者对照组，AMI及AIS组tHcy与TFAg、TF活性均有相关关系(P<0.05)，但组间差异并无统计学意义(P>0.05)。
　　 5)CKD患者多元逐步Logistic回归分析，结果显示血浆tHcy、LDL-C是CKD患者并发急性心脑血管血栓性疾病的危险因素(回归系数分别为0.194，0.114)。
　　 结论：在CKD患者急性心脑血管血栓性疾病中，患者tHcy和TF水平均显著增高，且二者呈正相关，提示tHcy可能与Mo TF产生增加有关，导致急性心脑血管血栓性疾病的发生。
　　 第三部分
　　 目的：通过对不同浓度的Hcy培养下，CKD患者外周血Mo TF基因和蛋白表达的情况，核因子NF-кB抑制剂对Hcy诱导人血Mo TF的表达的影响作用，探讨Hcy对Mo TF转录、表达的作用机制，为临床上研究CKD患者并发心、脑血管病的发病机制及预防提供实验理论依据。
　　 方法：CKD患者10例(GFR均<60ml/min)，均未开始血液透析治疗抽取静脉血。分离培养单核细胞，采用不同浓度(10、50、100μmol/L、500μmol/L)Hcy的RPMI1640完全培养液培养，细胞同时设阴性(PBS)对照，其中100μmol/LHcy组分别在0.5h、1h、2h、3h、4h检测各指标，其余各组在4h检测各指标。PDTC组在加500μmol/LHcy前先给予100mmol/LPDTC处理细胞。采用双夹心ELISA法检测产生的TFAg，一期凝固法测得PCA，并用RT-PCR方法检测Mo TFmRNA表达水平，Western blot方法检测NF-кBp65蛋白表达情况，观察不同浓度Hcy对单核细胞TFAg、PCA、NF-кBp65蛋白的影响，以及PDTC对其干预作用。
　　 结果：1)CKD患者外周血单核细胞培养，如不加Hcy诱导，其上清液中TF含量极低，与正常人体内血浆TF含量相差无几。外周血单核细胞培养中添加不同浓度Hcy可发现上清液中TF含量明显增高，随着Hcy浓度的增加，TF在CKD患者外周血单核细胞的表达水平逐步增高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。100μmol/LHcy作用0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h TFAg分别为92.6±18.7、109.1±27.3、110.3±20.7、290.0±17.5、341.8±35.8pg/ml，组间差异有统计学意义(P<0.05)，表明Hcy诱导TFAg的生成呈时间依赖性(P<0.05)。
　　 2)检测各组Mo的PCA结果显示，与静息细胞比较，Hcy干预的Mo的PCA显著增加，且呈剂量依赖性(P<0.05)，100μmol/L Hcy作用0.5h、1h，PCA与静息细胞基本相同，而在2h、3h、4h PCA分别为17.15±1.93、31.75±2.66、37.29±3.62mU，有时间依赖性(P<0.05)。
　　 3)结果表明随着Hcy浓度的增高，TF表达相应增加，500μmol几Hcy作用4小时达高峰(P<0.05)；结果还显示100μmol/L Hcy作用0.5h、1h无表达，2h、3 h、4 h Mo TFmRNA逐渐升高，组间差异有统计学意义(P<0.05)，表明Hcy呈浓度和时间依赖性诱导Mo组织因子mRNA表达(P<0.05)。
　　 4)Hcy可诱导单核细胞TFmRNA表达及TFAg的生成，并具有凝血活性，其作用高峰期在4h。Hcy同时可增加单核细胞NF-кBp65蛋白表达，高峰期在1h，至第2h、4hNF-к Bp65蛋白表达逐渐减弱。但如果在给予Hcy刺激前先给予100mmol/LNF-к B的抑制剂PDTC，则可见TFmRNA和TFAg、PCA及NF-к B p65的蛋白表达明显降低，与Hcy组相比，差异有显著统计学意义(P<0.05)。Hcy+PDTC组的NF-кB p65的蛋白表达甚至与对照组相似。PDTC对Hcy诱导的TFmRNA抑制作用在2h左右达高峰，随后抑制作用逐渐减弱，而对NF-кB p65的抑制作用在1h左右即达到高峰，表明Hcy对TFmRNA的诱导表达作用可被NF-кB的抑制剂PDTC给抑制，且其抑制作用晚于对NF-кB的抑制作用。
　　 结论：Hcy诱导Mo表达TF可能是CKD患者急性血栓性心脑血管疾病的原因之一，NF-кB途径参与了Hcy诱导Mo TF表达的调节。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

第一部分 慢性肾脏病患者高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化及心脑血管疾病的相关研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 CKD患者急性心脑血管血栓性疾病与血浆同型半胱氨酸水平及单核细胞组织因子水平的观察

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 同型半胱氨酸对CKD患者外周血单核细胞组织因子表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

综述一

综述二

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

外文论文一

外文论文二