早期地塞米松干预对野百合碱性肺动脉高压大鼠的逆转作用

摘要

研究背景及目的:肺动脉高压(PAH)是一种主要由小血管病变导致的肺动脉平均压力升高及进行性右心衰竭和最终死亡的严重疾病。肺动脉高压是指孤立的肺动脉血压增高，而肺静脉压力正常。肺动脉高压的定义为静息海平面状态下，经右心导管测定肺动脉平均压力(mPAP)≥25mmHg，且肺毛细血管楔压≤15mmHg，肺血管阻力(PVR)>3Wood单位；其共同的病理改变为内皮细胞的损伤、动脉壁的增厚和肺小动脉的阻塞。
　　 除此之外，肺动脉高压是系统性红斑狼疮、硬皮病、混合性结缔组织病等系统性炎性疾病的常见并发症，其发生机制可能是自身免疫性血管炎的结果；而在其它如HIV感染等免疫失衡的过程中，均能并发严重的肺动脉高压。特发性PAH(IPAH)是PAH的一种，指没有PAH基因突变和明确危险因素接触史的一类特定疾病。临床资料证实IPAH患者可检测到自身抗体及炎症细胞因子，如血清IL-1、IL-6水平的明显增高。IPAH病人及野百合碱(MCT)性动物模型中肺组织病理检测均可发现肺血管周围的炎症细胞浸润。但是关于炎症及免疫反应在肺动脉高压中的发病机制，尚未完全明了。
　　 野百合碱是双吡咯类生物碱，通过皮下注射，在肝脏内经P450单氧化酶转化形成具有生物活性的吡咯野百合碱，后者经由血液循环到达肺脏并沉积于肺脏毛细血管及肺细小动脉壁，引起肺动脉血管壁内皮细胞的不可逆损伤，进而影响血管壁细胞间的调控导致肺血管结构重建、肺动脉压力升高和右心室肥厚及衰竭。严重肺高压患者血管损伤周围可见明显T细胞和B细胞浸润，但是关于这些免疫细胞如何发挥作用尚无定论。CD4+和CD8+T淋巴细胞在细胞免疫中发挥重要作用；因此，本实验首先通过免疫组化的方法对肺血管周围的T淋巴细胞分布进行初步定位。其次，作为CD4+T淋巴细胞其功能亚群之一的辅助性T细胞(Th cells)，既能促进B淋巴细胞产生抗体，亦能促进T淋巴细胞分化成熟，其分泌的细胞因子可分类为Th1和Th2型细胞因子，其免疫失衡与疾病的发生、转归、预后密切相关；本研究选取IFN-γ和IL-4分别作为两种类型细胞因子的代表，进一步了解肺部细胞因子的表达变化情况。所有免疫细胞到达作用靶位均需首先与内皮细胞相互作用，如滚动、黏附、渗出；趋化因子在其中发挥关键作用。一种主要由血管内皮细胞分泌兼有粘附和趋化作用的因子Fractalkine(Fkn/CX3CL1)成为关注的热点，Fkn以膜结合型和游离型两种分子形式存在，前者发挥粘附分子作用，后者发挥趋化作用；其受体CX3CR1则主要由淋巴细胞和单核细胞分泌。因此对该因子及其受体的研究对了解肺血管内皮细胞的损伤及免疫细胞的游走浸润具有重要意义。
　　 地塞米松(Dex)作为一种糖皮质激素，其抗炎及免疫抑制功能已众所周知。地塞米松通过与糖皮质激素受体及转录因子尤其是核因子(NF)-κB、活化蛋白(AP-1)相互作用，在基因水平抑制多种细胞因子、粘附分子、趋化因子等的表达。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)，一种NF-κB抑制剂，已被动物实验证实可降低MCT性大鼠肺动脉高压。
　　 目前肺动脉高压的治疗发生了明显变化，除外吸氧、利尿剂、华法林和地高辛等常规治疗，在钙离子拮抗剂扩张肺血管基础上，又加用了前列环素类药物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂等新型药物，兼顾了改善内皮功能、阻抑肺血管重塑等综合治疗模式。有资料表明IPAH的5年生存率已提高到66％，但由于其诊断、治疗的复杂性，及药物使用的局限性和昂贵性，而且终末期的患者只能依赖肺移植这一手段尚能存活；新的药物应用亟需开发。
　　 因此，地塞米松是否具有同样的降肺动脉压作用?可否作为肺高压的一种联合治疗?其可能的作用机制是什么?能否对肺血管内皮起到一定的保护作用?其对免疫细胞的影响及其分泌因子的表达有何影响?本实验通过与PDTC作比，观察地塞米松对肺动脉高压的治疗作用，并检测肺血管周围的T淋巴细胞浸润及Th细胞分泌的细胞因子的基因表达情况，为炎症及免疫反应在肺高压发病中的作用提供客观依据。
　　 研究方法:
　　 1.大鼠PAH模型的建立以及实验分组：将64只Wistar大鼠随机分为2组：①PAH模型组：32只大鼠随机分为4组(每组8只)，以腹腔注射MCT为标准，分别记为对照组(注射生理盐水组)、1wk-MCT组(注射MCT后1周)、2wk-MCT组(注射MCT后2周)和3wk-MCT组(注射MCT后3周)；分别于注射MCT前及注射后1周、2周、3周时处死。②PAH治疗组：32只大鼠随机分为4组(每组8只)，分为对照/盐水组，MCT/盐水组(即PAH组)，MCT/PDTC组(即PDTC组)，MCT/Dex组(即Dex组)，均于第3周处死；对照/盐水组一次性腹腔注射与MCT等量生理盐水，2日后以生理盐水(1ml/kg)行腹腔注射，每日1次：PAH组、MCT/PDTC组和MCT/Dex组分别一次性腹腔内注射MCT(50mg/kg)，2日后分别以生理盐水(1ml/kg)、PDTC、Dex行腹腔注射，每日1次。
　　 2.大鼠血流动力学和右心室肥大指数测定：大鼠称重，经3％戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后，取右侧颈外静脉，将测压导管一端送至右心室，另一端通过压力换能器与生理记录仪相连，记录右心室收缩压力(RVSP)，代替肺动脉收缩压。分离右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)，电子天平称重，以RV/(LV+S)的比值作为右心室肥大指数(RVHI)。
　　 3.肺动脉周围CD4+和CD8+T细胞计数：免疫组化法检测。
　　 4.肺组织细胞因子IL-4和IFN-γ基因表达测定：实时定量PCR检测。
　　 5.肺组织FKN及CX3CR1基因表达测定：实时定量PCR检测。
　　 6.血清细胞因子IL-4和IFN-γ浓度测定：酶联免疫吸附实验(ELISA)定量检测。
　　 7.统计学处理：实验数据计量资料采用均数±标准差表示，使用SPSS16.0统计软件分析。两组间比较采用配对或独立样本t检验；各组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为有统计学差异。
　　 结果：
　　 1.肺血管病理改变：光镜下可见：对照组大鼠肺血管内皮细胞连续性良好，肺泡无水肿、淤血，肺泡腔内无渗出；而PAH组大鼠肺小动脉内皮细胞肿胀、变性、坏死和脱落；血管腔变小，中膜平滑肌细胞明显增生，肺泡壁毛细血管淤血，肺间质增厚，并伴有管壁周围炎性细胞浸润。
　　 2.右心室压力和右心室肥厚指数：①PAH模型组：与正常对照组比较，从第2周开始，大鼠右心室收缩压就开始升高，第3周时继续增高；右心室肥厚指数具有与此相同的表达趋势；②PAH治疗组：PDTC及Dex均可使PAH组大鼠RVSP和RVHI数值降低，但Dex组与PDTC组相比疗效更佳。
　　 3.肺组织细胞因子IL-4和IFN-γmRNA基因表达：实时定量PCR检测提示：①PAH模型组：与正常对照组相比，IL-4 mRNA表达前2周略有降低，但差异均无统计学意义；第3周时IL-4 mRNA表达与正常对照组大鼠基本相同水平。第3周时IFN-γ基因表达明显增强，差异有统计学意义。②PAH治疗组：与对照组比较，PAH组大鼠IFN-γmRNA表达明显增高，而IL-4mRNA表达未见明显变化。同PAH组比较，PDTC组和Dex组IFN-γmRNA表达均明显降低；但IL-4mRNA表达增高，且Dex组差异有统计学意义。
　　 4.肺组织FKN及CX3CR1基因表达：实时定量PCR检测提示：FKN基因表达随肺高压病程进展逐渐下降，到第3周时表达最少，与正常对照组比较差异有统计学意义。CX3CR1 mRNA第2周时表达最多，第3周略降，与正常对照组比较差异均有统计学意义。同PAH组比较，PDTC组和Dex组Fkn mRNA表达均增高，CX3CR1mRNA表达均降低，且Dex组差异有统计学意义。
　　 5.血清细胞因子IL-4和IFN-γ浓度：ELISA检测提示：①PAH模型组：各组别间均无明显差异；②PAH治疗组：各组别间IFN-γ血清浓度未见明显异常，各组间差异无统计学意义。IL-4血清浓度除PDTC组与正常对照组差异有统计学意义，余组均无明显差异。
　　 6.CD8+T细胞计数：免疫组化提示：①PAH模型组：CD8+T细胞计数在病程前2周虽有升高，但差异无统计学意义；第3周细胞计数明显升高；②PAH治疗组：与对照组比较，PAH组大鼠CD8+T细胞明显增多；同PAH组比较，PDTC组和Dex组CD8+T细胞明显降低；同PDTC组比较，Dex组CD8+T细胞亦明显降低，且差异具有统计学意义。
　　 7.CD4+T细胞计数：免疫组化提示：①PAH模型组：与正常对照组比较，CD4+T细胞计数逐渐升高；②PAH治疗组：与对照组比较，PAH组大鼠CD4+T细胞明显增多；同PAH组比较，PDTC组和Dex组CD4+T细胞无明显变化；同PDTC组比较，Dex组CD4+T细胞差异亦无统计学意义。
　　 研究结论:
　　 1.MCT组大鼠病程第2周时即出现右心室压力升高和右心肥厚指数增高，第3周时明显加重，表明MCT诱导的肺动脉高压模型建立成功。
　　 2.肺高压进展伴随Th1和Th2型细胞因子的基因表达变化，提示细胞因子在肺高压发病中扮演重要角色。
　　 3.严重肺高压大鼠(第3周时)Fkn基因表达明显减低，提示肺血管内皮细胞可能严重受损，而PDTC及Dex对此均有所改善，并以后者为著。
　　 4.肺高压大鼠CX3CR1基因表达的增高提示肺组织炎症细胞浸润的增多，而Dex可明显抑制CX3CR1基因表达，提示其对炎症细胞在肺部浸润的抑制作用。
　　 5.严重肺高压大鼠肺血管周围CD8+T细胞计数渐增，而PDTC及Dex明显抑制了CD8+T细胞在肺血管周围的浸润，提示CD8+T细胞在肺动脉高压发病机理中的重要作用。CD4+T细胞的变化表明该类型T细胞可能对肺血管有一定的保护作用。
　　 6.血清IL-4和IFN-γ细胞因子浓度变化提示此剂量的Dex可能尚未对大鼠整个体内环境的细胞免疫系统产生明显干扰。
　　 7.地塞米松可显著降低肺动脉压力，保护肺血管内皮，减轻肺血管重塑，具有一定的临床应用前景。
　　 创新和意义：
　　 1.本实验应用MCT诱导建立大鼠肺动脉高压模型，从多角度、多方面证实揭示炎症及免疫病理与肺血管重塑的关系，进一步阐明了其在在肺高压发病中的潜在作用，为以该机制为靶点的药物治疗提供了有力的理论依据。
　　 2.体内试验证实了Th1/Th2类细胞因子基因表达变化及T细胞亚型与肺高压血管病变的关系，为细胞因子治疗或抗体治疗提供了新视角。
　　 3.本实验应用地塞米松治疗，观察其对肺动脉高压大鼠及其病理改变的影响，证实此类药物可以通过炎症及免疫抑制作用抑制肺高压的进展，并可达到逆转肺高压的作用，为临床应用糖皮质激素类药物治疗肺高压提供新的理论和实验依据。