siRNA靶向抑制CPB2基因对乳腺癌细胞TAFI表达及生长和转移性影响的体外实验研究

摘要

目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害患者生命健康。患者在癌症早期即可发生病灶转移，不利于乳腺癌的有效控制和治疗，因此乳腺癌的抗转移治疗成为研究的热点。
　　 凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)是一种新发现的主要由肝脏分泌的具有血浆羧肽酶样活性的单链糖蛋白。TAFI被凝血酶、纤溶酶及凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物(T-TM)等激活形成活化TAFI(TAFIa)， TAFIa可以降解部分水解的纤维蛋白C末端的赖氨酸残基，抑制纤溶酶的活化，高浓度TAFIa还可以直接抑制纤溶酶的活性，进一步下调纤溶系统的活性，与临床心、脑血管性疾病，肿瘤等许多疾病具有密切联系。TAFI浓度受编码基因羧肽酶B2(CPB2)控制，CPB2定位于13q14.11，TAFI mRNA翻译合成由423个氨基酸组成的蛋白质，包括22个氨基酸组成的信号肽，92个氨基酸组成的活性肽和309个氨基酸组成的活性催化域。
　　 本研究以乳腺癌MDA-MB-231细胞系为研究对象，利用RNA干扰技术，通过设计小于扰RNA（siRNA），使其靶向抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞系中CPB2基因的表达，检测RNA干扰后乳腺癌细胞中TAFI表达水平；并探讨TAFI对乳腺癌细胞生长和转移的影响；研究肿瘤与凝血、纤溶系统的关系；结合相关研究进一步发现肿瘤治疗的新思路。
　　 方法：
　　 1．复苏，培养乳腺癌MDA-MB-231细胞系，至对数生长期传代；
　　 2．设计并化学合成编码TAFI基因(CPB2)的3条候选特异性siRNA和1条非特异性siRNA，将细胞分为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、阴性对照组和空白对照组5组，用脂质体2000转染至MDA-MB-231细胞中；
　　 3．RT-PCR检测转染后5组MDA-MB-231细胞中TAFI mRNA的表达；
　　 4．采用Western Blot的方法检测转染后5组MDA-MB-231细胞中TAFI蛋白表达；
　　 5．经过RT-PCR和Western Blot实验的结果筛选出抑制率最高的siRNA，进一步进行Transwell侵袭实验检测转染后MDA-MB-231细胞转移侵袭能力，与阴性对照组和空白对照组进行比较；
　　 6．四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定转染后MDA-MB-231细胞存活和生长情况，与阴性对照组和空白对照组进行比较。
　　 结果：
　　 1．将细胞分5组成功转染后，RT-PCR检测发现siRNA-1组，siRNA-2组，siRNA-3组与阴性对照组比较，TAFI mRNA表达水平显著下降；
　　 2．Western Blot检测5组细胞TAFI蛋白表达量，发现siRNA-1组，siRNA-2组，siRNA-3组与阴性对照组比较，TAFI蛋白表达水平显著下降，3个siRNA转染组的抑制率分别为(55.4±4.9)％，(55.0±0.6)％，（42.6±3.5）％；
　　 3. RT-PCR和Western Blot筛选出siRNA-3为抑制率最高的siRNA， Transwell侵袭实验发现该组转染后细胞的侵袭和转移能力较阴性对照组明显降低；
　　 4．MTT实验显示TAFI表达受抑制的siRNA-3组细胞的生长受到抑制，存活率降低。
　　 结论:
　　 1．RNAi技术成功抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞系中TAFI的表达，使得乳腺癌细胞TAFI mRNA和TAFI蛋白含量明显降低，尤其是 siRNA-3组的抑制作用最显著，故筛选出siRNA-3进一步研究TAFI对乳腺癌细胞生长和转移的影响。
　　 2．TAFI水平的降低能够使乳腺癌细胞的生长活性和侵袭力明显降低。
　　 3．TAFI通过对纤溶过程的抑制从而降低肿瘤细胞的细胞活性以及侵袭力，与肿瘤的发展和转移有着非常密切的关系，也为肿瘤治疗提供了新思路。