靶向AML1/ETO的siRNA增强Kasumi-1细胞对组蛋白去乙酰化酶化酶抑制剂的敏感性

摘要

背景：AML1/ETO融合基因阳性白血病是急性髓系白血病的一种亚型，其特点是存在t(8；21)(q22;q22)染色体异位，及异位后形成的融合基因AML1/ETO，该融合基因通过多种途径导致白血病的发生。AML1/ETO融合基因可以通过激活JNK信号转导途径，使c-jun表达上调，从而抑制造血细胞的凋亡；干扰粒细胞分化因子C/EBPα的表达，而后者对髓系细胞的分化及血细胞的功能有重要作用；竞争性抑制ETO-2和N-CoR的相互作用，阻碍粒细胞的分化；抑制造血相关基因AML1及下游靶基因的功能；通过下调AES而完成自我更新。另外，AML1/ETO融合基因可作为转录抑制因子，与核受体抑制复合物N-CoR/Sin3/HDAC结合，活化组蛋白去乙酰化酶(histone acetylation enzymes，HDACs)，使组蛋白去乙酰化，抑制AML1靶基因的转录，达到竞争性抑制AML1基因的作用，干扰正常的造血功能，导致白血病的发生。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone acetylation enzyme inhibitors，HDACIs)丙戊酸钠(valproate，VPA)是一种临床上广泛应用的抗癫痫药物，该药也可以诱导细胞分化和凋亡、调节细胞周期而发挥抗增殖效应，在多种肿瘤中发挥抗肿瘤效应。研究发现VPA通过破坏异常的HDAC功能而有效地缓解AML1/ETO融合基因介导的白血病生成。RNA干扰技术是利用双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱导序列特异的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。本研究以AML1/ETO融合基因阳性的Kasumi-1细胞株为研究对象，以RNAi技术为平台，研究AML1/ETO基因沉默后Kasumi-1细胞株的生物学改变及对VPA的敏感性变化，探讨AML1/ETO基因沉默是否能增强VPA的抗肿瘤效应。
　　 目的：构建针对AML1/ETO融合基因的RNA干扰表达质粒载体，探讨AML1/ETO融合基因沉默后kasumi-1细胞株的生物学改变及对组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)丙戊酸钠(VPA)的敏感性变化。
　　 方法：根据AML1/ETO融合基因表达序列设计有效的RNA干扰片段，将其构建入质粒表达空载体中，获得针对AML1/ETO融合基因mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-AML1/ETO)。体外培养AML1/ETO融合基因阳性的人急性髓系白血病细胞株kasumi-1，脂质体介导重组质粒pGCsiRNA-AML1/ETO转染kasumi-1细胞，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Kasumi-1细胞AML1/ETO和Bcl-2 mRNA的表达变化；MTT法检测VPA对细胞增殖的影响；流式细胞术(FACS)检测细胞周期；Hochest33258染色后荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。
　　 结果：靶向AML1/ETO融合基因的siRNA质粒可有效降低Kasumi-1细胞AML1/ETO融合基因的表达：与空白对照组相比，转染pGCsiRNA-AML1/ETO组细胞AML1/ETO基因mRNA的表达量下降了53.7％(p＜0.05），同时Bc1-2 mRNA的表达量下降了54.5％(p＜0.05)，而阴性对照组及脂质体组两基因的表达量无明显变化；VPA对Kasumi-1细胞增殖的抑制效应呈浓度、时间依赖性，不同VPA浓度作用下，转染组细胞24、48h的增殖抑制率均高于空白对照组（p＜0.05），而阴性对照组及脂质体组与空白对照组相比无明显变化。空白对照组及转染组细胞G0/G1期比例分别为(42.07±5.23)％和(62.6±5.87)％(p＜0.01)，经含2mmol/LVPA的培养基培养48h后，两组细胞G0/G1期比例分别上升至(69.2±7.02)％和(78.92±6.23)％（p＜0.01）；转染后细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。
　　 结论：特异性AML1/ETO siRNA可显著抑制Kasumi-1细胞AML1/ETO基因的表达，诱导凋亡，抑制增殖，使周期阻滞，并明显增强VPA对Kasumi-1细胞的生长抑制。