血小板MHCI类抗原分子介导CD61特异性细胞毒性T细胞免疫耐受的机制研究

摘要

研究背景：免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia, ITP）一种获得性自身免疫性疾病，以免疫因素介导的血小板减少为特征，是临床最常见的出血性疾病。该病可能的发病机制包括自身反应性抗体和/或细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的血小板破坏增多以及巨核细胞成熟障碍所致的血小板生成减少。近年来，对ITP发病机制的研究取得一系列新进展，T细胞亚群功能异常和细胞因子比例失调在疾病发病过程中的作用一直是研究的热点问题。近年来，有学者提出人类白细胞抗原(human leukocyte antigen， HLA)基因位点突变与ITP发病过程存在一定联系，亦有关于MHCⅠ类抗原介导CTL免疫耐受的相关报道。在疾病的治疗方面，对血小板输注的临床意义仍存在争议，临床研究报道提示血小板输注安全有效，但缺乏理论依据支持，国际工作组最新共识仅将血小板输注作为紧急治疗措施推荐。因此，利用新型ITP小鼠模型对CD61特异性CTL在ITP发病过程中的作用进一步研究并探讨血小板MHCⅠ类抗原分子对其免疫耐受的诱导作用，对揭示ITP的发病过程及寻求安全有效的治疗方案以指导临床治疗均具有重要意义。
　　 研究目的：通过使用三种不同类型血小板免疫BALB/cCD61基因敲除(knockout． KO)小鼠并检测被免疫小鼠血清中抗体水平，比较近血小板表面糖蛋白(Glycoprotein， GP) GPIIIa（即CD61）分子与MHCI类抗原分子所诱导免疫应答反应的异同；利用新型ITP小鼠模型，探索CD61特异性CTL在ITP发病过程中可能的作用途径，及MHCI类抗原分子与CD61特异性CTL间的相互作用；研究血小板MHCI类抗原分子在ITP治疗中的意义并为临床应用血小板输注提供理论依据。
　　 材料和方法：
　　 1．研究对象：使用8-12周的BALB/c(H-2d)健康小鼠作为空白对照，使用8-12周的BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)及C57BL/6CD61KO小鼠作为血小板供体；使用8-12周BALB/cCD61基因敲除小鼠作为血小板输注受体及脾细胞移植供体；8-12周CB17(H-2d)重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency， SCID)小鼠作为脾细胞移植受体。
　　 2．使用BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)及C57BL/6CD61KO小鼠血小板分别免疫BALB/cCD61KO小鼠，并通过检测小鼠血清中血小板特异性IgG抗体滴度监测小鼠所获得的免疫应答强度。
　　 3．收获具有较高抗体滴度的BALB/cCD61KO小鼠脾脏，分离单个脾细胞，保留所有细胞亚群或分离去除CD19+B细胞，分别移植给BALB/cSCID小鼠，观测小鼠临床表型、监测血小板计数，并于4周后收获小鼠，行骨髓病理学检测，观察小鼠骨髓中巨核细胞形态、数目的变化。
　　 实验结果：
　　 1．在应用三种不同类型血小板分别免疫BALB/cCD61KO小鼠第5周末，小鼠血清中血小板特异性IgG抗体滴度均≥1：400，提示血小板表面GPIIIa及同种异型MHCⅠ类分子均可诱导小鼠产生相应免疫应答。其中，第1、3组抗体水平(＞1：12000)较第2组(1：400)高。
　　 2．将具有相应免疫性的脾细胞（抗CD61、抗MHC及抗CD61/MHC双阳性），保留/去除CD19+B细胞亚群后，分别移植给6组BALB/cSCID小鼠，实验组1、2组小鼠血小板计数在第2-4周与对照组相比显著降低(P＜0.05)，并有相应出血表现，部分小鼠死亡，骨髓病理切片中巨核细胞呈成熟障碍象且巨核细胞计数显著高于对照组(P＜0.05)，表明ITP小鼠模型构建成功。
　　 3．接受脾细胞移植的实验组3、4组小鼠在血小板计数、临床表现、巨核细胞形态及计数等方面均与对照组小鼠无显著性差异(P＞0.05)；实验组第5组小鼠血小板计数持续减低并出现类似ITP小鼠表现，而第6组小鼠血小板计数在第2周开始上升，并未出现ITP类似表现(与对照组相比P＞0.05)，表明抗MHC免疫性并未阻断T、B细胞共同介导的ITP，但成功阻断了T细胞介导的ITP，提示同种异型血小板MHCⅠ类抗原分子可成功诱导CD61特异性CTL免疫耐受。
　　 结论：我们的研究表明，血小板特异性抗原CD61及同种异型MHCI类抗原均可诱导小鼠产生相应的免疫应答；新型ITP小鼠模型能够成功地模拟人体ITP发病的免疫学机理，CD61特异性CTL在发病过程中发挥了重要作用，而同种异型血小板MHCI类抗原可以成功诱导该CTL免疫耐受；这一实验结果也提示，对ITP患者应用血小板输注不仅安全有效，还有治疗作用。