原生质体诱变技术在九州虫草优良菌株选育中的应用

摘要

虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]真菌是一大类昆虫病原真菌,其生活史包括无性型和有性型两个阶段,即具有世代交替现象。虫草是昆虫病原真菌侵染寄主昆虫所形成的一种特殊形态,其中冬虫夏草是最为名贵的一种,具有多种药理作用,主要产于青、川、滇、藏3000-5000米的高原地区;九州虫草(Cordyceps kyushuensisKob)是1996年在蒙山发现的一种以豆天蛾(Clanis bilineata Walker)幼虫为寄主的虫草,其无性型为九州轮枝菌,研究表明九州虫草含有多种生物活性物质,具有很高的药用价值。由于冬虫夏草生长环境比较苛刻,产量有限,且价格昂贵,而九州虫草已经实现了人工栽培,可以为九州虫草的深入研究提供丰富的原材料,因此本实验选择九州虫草作为育种研究的对象。虫草中核苷类物质的含量是评价其质量的重要指标,因此本研究以虫草素、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、鸟苷和尿苷这7种核苷类物质作为九州虫草诱变育种的目标物质。
　　 本研究以蒙山和沈阳两个产地的野生九州虫草作为原生质体诱变育种的亲本菌株。第一步,制备两个亲本菌株的原生质体;第二步,对其原生质体进行紫外线单因子诱变和紫外一亚硝酸复合诱变,挑取诱变之后得到的原生质体再生菌株转接到PDA斜面上进一步培养,然后通过摇瓶发酵培养得到各诱变菌株的菌丝体;第三步,利用超声破碎提取法制备九州虫草亲本菌株和诱变菌株菌丝体的水提取液,然后利用毛细管区带电泳法检测各水提液中虫草素、腺嘌呤、尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、鸟苷和尿苷7种物质的含量,通过诱变菌株与亲本菌株菌丝体中这7种物质含量的比较,得到各种不同的诱变高产菌株,并进一步对高产菌株进行遗传稳定性检测;第四步,利用生化标记和分子标记技术对得到的高产菌株进行遗传变异研究。
　　 在进行第一步时对影响原生质体制备和再生的因素进行了研究,这些因素包括菌丝体的菌龄、渗透压稳定剂的种类和浓度、酶解时间、酶解温度以及酶体系的组成。通过单因子实验得到原生质体制备和再生的最佳条件为:取菌龄为6 d的菌丝体,用1％蜗牛酶+0.5％纤维素酶(体积比1:2),35℃,酶解2.5 h,所用渗透压稳定剂为0.6 mol/L的MgSO4,所得原生质体制备率为1.68×108个/mL,将原生质体悬液涂布在以0.6 mol/L的蔗糖为渗透压稳定剂的固体再生培养基上,得到的再生率为9.32％。
　　 在第二步和第三步实验中,对九州虫草原生质体进行了紫外线单因子诱变和紫外-亚硝酸复合诱变后,利用高效毛细管区带电泳法筛选得到8株具有遗传稳定性的高产菌株,它们分别为菌株U2,U4,U7,U13,H6,H9,H26和H31,其中菌株U13,H6,H9,H26和H31菌丝体中虫草素的含量分别是亲本菌株的2.12,1.69,1.76,1.73和1.41倍;而菌株U2,U4和U7菌丝体中次黄嘌呤、鸟苷和尿苷的含量与亲本相比各有不同的提高。
　　 在第四步实验中利用了酯酶同工酶标记技术和ISSR-PCR技术对高产突变菌株进行了遗传变异研究,二者的分析结果表明,突变株的酯酶同工酶酶谱和基因组序列与亲本菌株不同,从而可以确定突变菌株生产性状的改变是由基因突变引起的,高产菌株是具有新基因型的菌株,其高产性状是一种可遗传性状,因而可以继续利用这些高产菌株进行进一步的育种研究。