G-CSF诱导APP转基因小鼠神经再生及对认知功能改善作用的研究

摘要

研究背景
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐袭的中枢神经系统退行性疾病，以记忆力进行性减退、认知功能障碍、行为活动异常为主要临床特征。其患病率约占老年痴呆病例的一半以上，随着人口老龄化的加重，阿尔茨海默病的发病率逐年增高。AD严重影响患者的工作能力和生活质量，也为家庭和社会带来沉重的负担。鉴于AD的发病机制尚未阐明，目前尚无理想的预防和治疗方法。
　　 AD的主要病理特征是在患者大脑皮质、海马、某些皮质下神经核出现老年斑(senile plaque，SP)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)，此外还有神经元缺失、星形细胞增生样反应、神经元突触异常等病理改变。AD的核心症状是认知功能进行性下降，谷氨酸能及胆碱能神经元丢失程度与患者智能衰退关系密切。因此，减少神经元丢失或增加神经再生是AD治疗的重要方向。
　　 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生的一种造血生长因子，能与细胞表面的特定受体结合，促使中性粒细胞系造血祖细胞生长和分化，保护中性粒细胞避免凋亡并加强它们的功能，G-CSF被广泛地应用于治疗由各种原因引起的粒细胞减少症。最近多项研究显示其对中枢神经系统也有多重效应，可促进骨髓源性干细胞向受损脑区迁移，抗细胞凋亡，促进神经细胞再生。神经干细胞存在大脑特定区域，特别是脑室下区(管膜)、嗅球和海马，这些区域均可表达G-CSF及G-CSFR。G-CSF具有神经保护作用，能促进组织形态修复和神经功能康复。近年来，对成年动物脑缺血模型的研究表明，应用G-CSF是一种有效治疗方法，Kawada等研究发现，缺血性脑卒中动物模型经G-CSF治疗，能通过动员骨髓干细胞而改善卒中后脑功能受损症状。国外应用G-CSF治疗成人缺血性脑卒中已进入Ⅰ、Ⅱ期临床观察阶段。
　　 根据以往研究推测，G-CSF可能通过促进神经再生治疗AD，改善AD患者的认知功能。本研究将G-CSF应用于APPV717I转基因AD模型小鼠，以探讨G-CSF能否促进神经再生和改善转基因小鼠认知能力。本研究共分三部分，如下：
　　 第一部分 G-CSF对阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响
　　 目的：对G-CSF治疗前后AD模型小鼠、对照组和野生小鼠进行生物行为学研究，利用水迷宫模型来测试各组小鼠学习记忆能力，探讨G-CSF能否改善AD小鼠模型的认知能力。
　　 方法：1.将10月龄AppV717I转基因AD模型小鼠和野生小鼠分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。G-CSF治疗组：连续7 d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组、野生组，连续7 d皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数，各组小鼠又分为三个亚组：7 d组，14 d组，28 d组。
　　 2.各组小鼠于注射前后分别进行水迷宫定位航行试验。
　　 3.利用统计软件对G-CSF治疗前后的AD模型小鼠及野生小鼠的水迷宫实验数据进行统计分析。观察G-CSF对AD模型小鼠认知功能的影响。
　　 结果：各组小鼠Morris水迷宫测试结果：AD模型组逃避潜伏期和游泳距离较野生组明显延长(P<0.01)，G-CSF治疗组显著缩短潜伏期和游泳距离，和野生组水平相当。同组大鼠，随着训练时段的增加，G-CSF治疗组的潜伏期和游泳距离越来越短(P<0.01)。各组小鼠游泳速度没有明显差异。可以排除因个体差异引起的不同。
　　 结论：G-CSF治疗后阿尔茨海默病小鼠认知功能改善。
　　 第二部分 G-CSF对阿尔兹海默病小鼠CD34+/CD45+细胞比例的影响
　　 目的：应用流式细胞学的方法观测G-CSF治疗前后APP转基因模型小鼠外周血中CD34+/CD45+细胞比例，探讨G-CSF对阿尔茨海默病模型小鼠骨髓造血干细胞的影响。
　　 方法：1.将10月龄APPV717I转基因AD模型小鼠分为对照组，G-CSF治疗组。G-CSF治疗组：连续7 d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组：连续7 d皮下注射PBS。
　　 2.给药第14 d Morris水迷宫测试后从小鼠眶后静脉丛取外周血0.5 ml，进行流式细胞学测试，观察2组小鼠外周血中CD34+/CD45+细胞比例。
　　 结果：治疗组小鼠外周血CD34+/CD45+细胞数较对照组明显增加(P<0.01)，约为对照组3倍。
　　 结论：1.G-CSF能提高AD模型小鼠外周血中CD34+/CD45+细胞的比例。
　　 2.G-CSF能够动员AD模型小鼠CD34+的骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)增殖并进入外周血。
　　 第三部分 G-CSF对阿尔兹海默病小鼠脑内神经元再生的影响
　　 目的：对G-CSF治疗前后AD模型小鼠脑组织切片进行免疫组化及免疫荧光双标检测，通过CD34+免疫荧光染色、Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+免疫荧光双重标记，观察G-CSF能否影响AD小鼠模型脑内的神经再生。
　　 方法：1.G-CSF治疗组：连续7 d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组：连续7 d皮下注射PBS。给药同时，两组动物给予BrdU(50 mg/kg·d)腹腔注射，连续10 d。
　　 2.在给药后14 d将两组小鼠多聚甲醛灌注取脑，冰冻切片，CD34+免疫荧光染色、Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+免疫荧光双重标记。
　　 结果：1.治疗组在给药后第14 d时脑内的皮质、嗅球及海马区可检测到红色的CD34+细胞。
　　 2.在两组小鼠脑内的皮质、嗅球及海马区均检测到BrdU+细胞，治疗组较对照组显著增加(p<0.05)。
　　 3.应用免疫荧光双标染色，在皮质、嗅球及海马区均可见Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+双阳性细胞，较对照组明显增加(p<0.05)。
　　 结论：1.G-CSF可诱导AD模型小鼠骨髓造血干细胞向脑内迁移。
　　 2.G-CSF能明显促进AD模型小鼠脑内细胞增殖。
　　 3.G-CSF可诱导AD模型小鼠脑中神经干细胞增殖并向神经元方向分化。
　　 研究意义
　　 本研究结果表明G-CSF皮下注射可明显改善APP转基因小鼠的认知功能，其作用机制为动员外周骨髓造血干细胞增殖、分化，并向脑内定向迁移；同时诱导脑内神经干细胞增殖、向神经元分化，从而替代丢失的神经元，修复病灶，为G-CSF治疗阿尔茨海默病提供了新的实验依据。